간흡충증의 혈청학적 진단을 위한 항원 단백질 발굴 현황

Current status of development and identification of antigenic proteins for serodiagnosis of clonorchiasis by immuno-proteomic analysis

     
질병관리본부 국립보건연구원 면역병리센터 말라리아·기생충과     
 

Ⅰ. 들어가는 말
   간흡충(Chinese liver fluke, Clonorchis sinensis)은 인체감염 시 담관에 기생하여 간흡충증(clonorchiasis)을 일으키며, 간흡충증은 우리나라를 비롯하여 중국, 베트남, 태국 등에 유행하는 만성 기생충질환이다[1]. 우리나라는 1970년대부터 시작된 장내기생충 퇴치사업으로 회충, 편충과 같은 토양매개성 기생충 감염이 크게 감소하였으나, 2004년에 실시된 제7차 전국 장내기생충 감염실태조사에  의하면 간흡충 감염과 같은 일부 기생충성 질환이 다시 증가된 것으로 나타났다. 제7차 장내기생충 감염실태조사 결과, 조사대상의 3.9%가 기생충 감염 양성 소견을 보였으며 이 중 85%가 간흡충 감염 양성자로 밝혀졌다[2]. 이러한 간흡충 감염 재증가의 원인은 일부 지역에서 민물고기를 생식하는 음식문화로 인해 높은 유병률이 유지되고 있고, 또한 강과 하천의 수질 개선과 주변 생태계의 복원 등으로 간흡충 생활사에 필요한 조건이 좋아졌기 때문으로 판단된다.
  간흡충증은 자각증상이 없는 경우가 대부분이며, 초기 증상은 간흡충에 의한 담도 상피조직의 국소적인 물리적 손상과 간흡충에서 분비되는 단백질 분해효소와 같은 여러 단백질들이 숙주 조직에 지속적으로 조직 손상 및 염증 반응 등을 일으키기 때문에 나타나는 것들이 대부분이다. 간흡충은 담관 폐쇄, 황달, 담관 섬유화, 간염, 소화불량, 간경화, 복수, 담관암 등을 일으키는 것으로 보고되고 있다[3].
이 글에서는 지금까지의 간흡충 항원 단백질 발굴 현황을 소개하고 면역단백체 분석을 통한 새로운 항원 단백질 발굴 방법에 대해 기술하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말

  간흡충의 생활사를 살펴보면 충란이 민물에서 섬모유충(miracidium)으로 부화되고 제1중간숙주인 쇠우렁(Parafossarulus manchouricus)에서 무성분열증식단계를 거쳐 유미유충(cercaria)이 되어 수중으로 나온다. 유미유충은 물속을 유영하다가 참붕어를 포함하는 제2중간숙주인 어류의 피부와 근육에 침입하여 피낭유충(metacercaria)이 된다. 인간을 포함한 포유동물들이 종숙주이며 피낭유충에 감염된 민물고기를 생식하여 간흡충에 감염된다. 피낭유충은 소장에서 탈낭 후 담관으로 이동하여 성충으로 성장한다(Figure 1).
                                     
  간흡충 감염은 대상자의 대변에 대한 현미경적 검사법으로 충란을 확인하여 진단한다. 충란 양성자에게 프라지콴텔(praziquantel)을 투여하면 구충할 수 있다. 현미경 대변검사법은 간흡충 충란을 확인하여  간흡충 감염을 직접적으로 진단하는 장점이 있다. 하지만 충체부하가 낮은 감염자의 경우에는 충란   검출률이 낮아져서 반복검사해야 하므로 정확한 진단에 장시간이 소모된다는 점과 충란의 형태와 크기를 기준으로 감염 여부를 판정하므로 장흡충류와 중복감염 시 충란을 감별진단할 수 있는 전문적인 기술이 필요하다는 단점이 있다. 따라서 현미경 검사자의 전문성을 강화시키기 위하여 진단검사요원 교육과  유지를 위한 노력이 경주되어야 한다.
  한편, 간흡충증 진단에는 현미경 검경을 통해 충란을 확인하는 기생충학적 진단 외에 감염자의 혈액에서 항체를 확인하는 혈청학적 진단법이 이용된다. ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay;  이하 ELISA)와 같은 면역혈청학적 검사법은 감염자의 혈액에서 간흡충 항원 단백질과 반응하는 항체를 검출하는 진단법이다. ELISA법은 민감도는 높은 반면, 다른 기생충 감염증과의 교차반응으로 인해 특이도가 낮으며 현미경 대변검사법에 비해 보다 잘 갖추어진 실험실 조건이 요구되는 단점이 있다. 또한 프라지콴텔을 투여하여 간흡충을 구충한 후에도 혈액 내에 간흡충 특이항체가 장기간 잔존하여 치료  여부를 판정하는 검사법으로는 적합하지 않다. 반면, 항원을 검출하는 면역학적 분석법은 항체를 검출하는 분석법에 비하여 현증 감염의 진단과 치료 추적에서의 유용성 그리고 높은 특이성을 나타내는 장점이 있다.
  흡충류 감염증 중 세계적으로 감염률이 높은 주혈흡충의 경우, 다양한 항원 단백질이 발굴되었으며, 순환성 항원(circulating antigen)을 이용한 항원 진단법이 개발되었다[4]. 또한 이를 바탕으로 주혈흡충 감염을 예방하거나 감염 후 성충으로의 성장을 억제할 수 있는 백신 개발 연구도 활발히 진행되어 동물실험에서는 백신 효과가 확인되었다[5]. 이에 비해 간흡충의 항원 단백질 발굴 실적은 상대적으로 빈약한 편이다. 따라서 면역학적 분석법의 정확도를 높이고 신속진단 키트를 개발하기 위하여 다양한 항원   단백질의 발굴이 절실하게 필요하다.
  간흡충의 경우, 우리나라를 중심으로 진단을 위한 항원 단백질에 대한 연구가 진행되어 왔다. 최근에는 간흡충 감염률이 높은 국가 중 하나인 중국에서도 항원 단백질에 대한 연구가 이루어지고 있다. 최근까지 확인된 간흡충에 대한 항원 단백질이 Table 1에 정리되어 있다.

  1980-90년대의 간흡충 항원 단백질에 대한 연구는 1차원 전기영동과 면역이적법 등을 통하여 분자량 수준에서 항원 단백질을 동정하였다. 90년대 후반 이후, 유전자 cloning과 재조합단백질 생산 및 정제 등 분자생물학적인 실험기법을 사용하면서 항원 단백질의 정확한 동정과 유전자 서열이 알려지기 시작하였다. 그 결과, 단백질 분해효소(주로 cysteine proteinase), 항산화효소들(glutathione S-transferase, superoxide dismutase), 충란 단백질들(york ferritin, vitelline 전구체, egg antigen) 및 표피 단백질(tegumental proteins) 등이 간흡충  감염 혈청에 대해 항원성을 나타내는 항원 단백질로 확인되었다. 22.3kDa tegumental protein과 cathepsin L 계열의 cysteine proteinase 재조합 단백질 또는 재조합 DNA를 이용한 실험동물 면역실험 결과에서는 각각 44.7%와 31.5%의 감염 억제효과를 나타냈다. 이들 항원 단백질을 이용한 간흡충증 혈청진단 키트의 개발이 진행되어 왔으나 아직까지 민감도와 특이도를 동시에 만족하는 수준의 결과를 확인하지는 못하였다. 실험실에서는 높은 민감도와 특이도가 확인되었으나 임상 시료에 적용하였을 때는 상대적으로  낮은 민감도와 특이도를 나타내었다. 이는 환자별 감염정도, 항원에 대한 특이항체 형성의 차이 등에  기인하는 것으로 해석된다. 따라서 다양한 항원 단백질 발굴을 통하여 환자별 항체 특이성을 극복하고, 감염 정도에 따른 항원 제시 정도를 표준화시키는 등의 연구 노력이 필요하다. 이러한 필요성에 따라 국립보건연구원에서는 2005년부터 병원성 단백체 관리사업을 추진해오고 있다. 간흡충으로부터 유래한 항원성 또는 면역원성 단백질을 발굴하여 각 병원체에 대한 다양한 항원물질을 확보하고, 각각의 면역작용기(immune epitope)를 규명하고 있다. 또한 이를 바탕으로 병원체 감염 신속 진단법과 백신 개발 등에 활용할 목적을 가지고 있다. 간흡충에 대한 항원 단백질을 발굴하기 위하여 면역단백체 분석기법을 이용하여 기존의 항원 단백질 외에 legumain 등을 포함한 13종의 항원성 단백질을 새롭게 확인하였다. 이들 항원 단백질의 확인을 위해 간흡충의 총 단백체 중 분비 단백질 시료를 수집하여 2차원 전기영동법으로 분리한 다음, 면역이적법을 통하여 간흡충 감염환자의 혈청에 반응하는 단백질을 확인하고 질량분석법을 이용하여 그 단백질을 동정하였다. Figure 2는 2차원 전기영동법으로 분리한 간흡충 분비 단백질의 결과를 보여 준다.
                                    
  2차원 전기영동 후 간흡충 감염환자 혈청에 반응하는 항원성 단백질을 확인한 결과, 기존에 보고된 cysteine protease(39, 43-50, 70, 71 단백질)의 항원성이 재확인되었고, 26, 28, 72번 단백질은 질량분석을 통하여 legumain이라는 항원성 단백질임을 최초로 확인하였다(Figure 3A). 간흡충 유래 legumain의 간흡충 환자 혈청에 대한 항원성을 검증하기 위하여 유전자 cloning 후 재조합 단백질을 생산하였다. 그 결과, 재조합 간흡충 legumain 단백질은 간흡충 환자 혈청에 대해서만 항원성을 나타내었으며 다른 기생충 감염환자의 혈청에 대해서는 교차반응을 보이지 않았다(Figure 3B). 이러한 결과를 통하여 면역단백체 분석 방법이 새로운 항원성 단백질의 발굴을 위한 효과적인 방법으로 확인되었다[6]. 현재 간흡충의 총 단백질을 2차원 전기영동, 다중 크로마토그래피와 같은 다양한 분리방법을 통하여 분리한 후 감염환자의 혈청에 반응하는 항원 단백질을 발굴하는 연구를 수행 중에 있다.
                                    
  한편 간흡충의 전사체(tranome) 분석을 통하여 약 6만개의 전사체 부분 서열을 확보하였다.  병원체 항원 단백질로는 주요 표적인 분비 단백질과 막 단백질에 대한 펩타이드 서열정보를 각각 421개와 1224개씩 확인하였다. 이를 바탕으로 재조합 단백질 발현과 단백질 칩 분석을 수행하여 항원성  단백질을 확인하고, 나아가 동정된 항원 단백질에 대한 항원 작용기를 규명하여 효과적인 혈청학적 진단 방법을 위한 간흡충 특이 항원 발굴을 진행하고 있다.

Ⅲ. 맺는 말

  최근의 감염성 병원체에 대한 연구는 유전학과 단백체학의 대단위 분석 기법을 이용한 다양한 항원성, 면역원성 단백질의 발굴과 기능 규명 등으로 이루어지고 있으며, 이를 바탕으로 신속 진단키트, 백신 및 치료제 개발을 위한 연구가 추진되고 있는 추세이다. 또한 최근 선진국을 중심으로 발생이 증가하고  있는 알러지질환과 자가면역질환의 증가 추세가 기생충 질환 감소와 관련이 있다는 위생가설, 암의   발생과 면역질환이 특정 병원체의 만성감염과 관련이 있다는 신질병매개설에 근거하여 기생충 감염질환에 대한 면역병리학적 연구의 관심도가 증가하고 있다.
  기생충 질환의 일차적인 관리의 효율성 증대를 위해 민감도가 높고 특이적인 혈청학적 진단법의 개발과 효과적이고 부작용이 낮은 백신의 개발은 필수적이다. 최근 기생충 분야의 연구는 이러한 요구에 부응하여 세계적으로 유행지역이 넓은 말라리아, 주혈흡충 등에 대한 유전체 서열정보 분석이 완료되었고, 각 발생 단계별 단백체의 특이발현 연구 결과가 보고되어 이를 바탕으로 효과적인 진단법 및 백신 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다.
  이에 비해 간흡충에 관한 연구는 주로 한국과 중국을 중심으로 이루어지고 있으며, 세계적으로는 그 감염 발생 분포가 제한적인 이유로 크게 주목받지 못하고 있는 상황이다. 그러나 우리나라는 간흡충이 장내 기생충 감염의 대부분을 차지하고 있고 잠정적으로 200만 명의 감염자가 있을 것으로 예상되는 만큼 자체적인 진단법과 백신 개발의 필요성이 부각되고 있어, 이를 위해 다양한 항원성, 면역원성 후보 물질을 찾는 것이 중요하다고 할 수 있다. 면역단백체학적 분석을 통한 간흡충의 항원 단백질 발굴 노력은 간흡충 감염에 대한 민감도와 특이도가 높은 혈청학적 진단법의 개발을 가속화시킬 것이며, 간흡충 감염의 억제와 감염 후 성충으로의 성장을 억제하는데 효과적인 백신 개발에 기여할 수 있을  것이다.

Ⅳ. 참고문헌

 1. Rim, H. J., Clonorchiasis: an update. J. Helminthol. 2005, 79, 269-281.
 2. The prevalence of intestinal parasitic infection in Korea, Korean Centers for Disease Control and Prevention and Korea Association of Health
     Promotion 2004.
 3. Georgios I. P., Karen E. S., Ramesh R. and Mordechai R. Clonorchis sinensis-associated cholangiocarcinoma: A case report and review of the
     literature. Digestive Diseases and Sciences. 2005, 50(11), 2159-2162
 4. Dam G. J., Wichers J. H., Ferreira F., Chati D., Amerongen A., and Deelder A. M. Diagnosis of schistosomiasis by reagent strip test for detection of
     circulating cathodic antigen. J. Clin. Microbiol., 2004, 42(12), 5458-5461
 5. Wu Z. D., Lu Z. Y., and Yu. X. B. Development of a vaccine against Schistosoma japonicum in China: a review. Acta Tropica. 2005, 96, 106-116
 6. Ju J. W., Joo H. N., Lee M. R., Cho S. H., et al., Identification of a serodiagnostic antigen, legumain, byimmunoproteomic analysis of excretory-
     secretory products of Clonorchis sinensis adult worms. Proteomics 2009, 9, 3066-3078.