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크로이츠펠트-야콥병의 실험실 진단 현황 및 환자 능동적 감시체계 소개
  • 작성일2011-02-01
  • 최종수정일2012-08-25
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7173

     

크로이츠펠트-야콥병의 실험실 진단 현황 및 환자 능동적 감시체계 소개
Current status of laboratory diagnosis for Creutzfeldt Jakob Disease(2005-2010) and introduction of the active surveillance system for CJD patients

질병관리본부 국립보건연구원 면역병리센터 신경계바이러스과         
김수연        
  


Ⅰ. 들어가는 말
  사람에서 발병하는 대표적인 프리온(prion) 질환인 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD)은 발생경로에 따라 산발성 CJD(sporadic CJD; sCJD), 유전성 CJD(genetic CJD, gCJD; Fatal familial insomnia, FFI; Gerstmann-Straussler-Scheinlcer Disease, GSS 등), 의인성 CJD(iatragenic CJD; iCJD)와 변종CJD(variant CJD; vCJD)로 구분된다(Table 1). 이 질환들은 수개월에서 수년간의 긴 잠복기를 가지며, 감염 뇌 조직에 공포(vacuole) 현상의 병변이 생기고, 염증반응이 일어나지는 않지만 이후 증세가 발현되면 100% 사망하는 치명적인 질환이다[1,2,3]. 발병 원인은 몸 안의 정상 프리온 단백이 변형 프리온 단백으로 구조를 바꾸어 병원성을 갖게 되기 때문이다. 전체 CJD의 85-90%를 차지하는 산발성 CJD는 운동실조를 보이다가 질병이 진행되면서 치매증상을 나타내게 된다. 환자발생 빈도는 100만 명당 1명 정도인 것으로 추정되고 있으며 우리나라의 CJD 의심환자 대부분도 이 유형에 속한다[4]. 유전성 CJD는 발생 원인이 정확하게 알려져 있지 않고 발병 후 운동실조, 치매증상을 나타내는 것은  산발성 CJD와 유사하다. 이외에 변종 CJD와 의인성 CJD는 병원체 감염물질을 복용하거나 의료기관에서 이식 등의 외과시술로 인해 전파된 경우로 전체 발병 중 약 2-5%를 차지한다[4, 5].  

  CJD를 진단하는 실험실 진단법으로는 의심환자의 뇌척수액에서 지표단백인 14-3-3 단백과 tau 단백을 검출하는 것과 혈액에서 프리온 유전자의 다형성을 확인하는 것으로 이루어진다. 또한 임상적 진단방법으로, 뇌자기공명영상(brain magnetic resonance imaging; MRI)분석과 뇌파기록 장치를 이용한 분석(electroencephalograph; EEG)이 있다[6, 7]. 하지만, 이들은 모두 진단의 보조적인 수단이며, 환자  확진을 위해서는 사후 뇌부검 또는 생검에 의한 신경병리학적 검사와 뇌조직 병변검사(Immunohistochemisty, 면역조직화학염색법)를 반드시 실시하여야 한다[8]. 현재 CJD 실험실 진단은 국립보건연구원 신경계바이러스과와 국가 지원으로 운영되고 있는 한림대학교 의과대학 내 CJD 진단협력센터에서 이루어지며, 부검 뇌조직 검사는 이 기관의 부검센터에서만 실시되고 있다. 신경계바이러스과에서는 2005년부터 CJD 전용 생물안전밀폐실험실(Biosafety Level 3; BL 3)을 설치하여 CJD 진단을 독립적으로 수행해 오고 있으며 해마다 신경과 관련 학회 및 임상의를 대상으로 CJD 의심환자군  검체 운송, 진단절차, 환자 발생에 따른 보고와 감시체계에 대한 자료배포 및 지침서 개정 등의 홍보  교육을 실시해 오고 있다. 노인인구 증가와 뇌신경질환 환자의 증가 등으로 CJD 진단의뢰 건수는 해마다 증가하고 있으며, 확진에 필요한 부검에 대한 일반인들의 생각도 장례 문화의 변화와 홍보활동 결과로 조금씩 긍정적으로 변화되고 있는 추세이다. 여기서는 국가 실험실에서 수행하고 있는 CJD 진단현황을 소개하고, 아울러, 2010년부터 기존의 수동적인 환자 감시체계를 보완하기 위해 양성으로 확인된 의심환자군들의 임상진단 및 경과를 일정기간 동안 추적 조사하는 능동적 감시체계를 수립하기 위한 연구가 진행되고 있어서 이를 소개하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말
  1. CJD 실험실 진단 검사법
  1) 14-3-3 단백 검출을 위한 웨스턴블롯법(Western blotting)
  CJD 의심환자의 뇌척수액에서 지표물질인 14-3-3 단백질을 검출하는 방법으로서 검체를 4배 표본 완충액과 혼합한 후 10분간 끓인다. 양성 대조군으로는 CJD로 확진된 환자의 뇌척수액이나 재조합단백질을 이용하며 의뢰 검체와 동일한 방법으로 처리한다. 그 후 양성 대조군 및 환자의 표본을 standard marker와 함께 Nupage 4-12% Bis-Tris gel의 각각 lane에 흘려 넣어준다. 100mA로 50분간 전기영동한 후, gel을 30V로 15시간 동안 membrane으로 옮기고, membrane은 메탄올에 1분간 담가 활성화시킨 후 5% skim milk에서  1시간 반응시킨다. 14-3-3 항체가 포함된 PBS-T에서 2시간 반응시킨다. PBS-T로 3회 씻어준 후 membrane을 horseradish peroxide-conjugated 된 2차 항체를 이용하여   1시간 반응시킨다. membrane을 PBS-T로 3회 씻어준 후 암실에서 enhanced chemiluminescence   시약으로 발광시킨 뒤 필름에 노출 시킨 뒤, 이를 현상, 고정하면 약 30 kDa 크기의 14-3-3 단백질을 검출할 수 있다(Figure 1).
                               
  2) 프리온유전자 염기서열 분석(DNA sequence analysis)
  CJD 의심환자의 프리온 유전자의 염기서열을 분석하기 위해서 환자의 혈액을 항응고제가 첨가된   폴리프로필렌 재질의 튜브에 채혈한다. 이를 DNA 분리 키트를 이용하여 염색체 DNA를 분리한다. 추출한 DNA에서 프리온 유전자의 코딩부위만 PCR(polymerase chain reaction)을 수행한다. 증폭된 PCR   생성물은 agarose gel에서 전기영동을 실시하고 확인된 DNA 밴드를 오려낸 다음 PCR 생성물 elution 키트를 이용하여 용출시킨 후  DNA 분석 프로그램을 이용하여 결과를 분석하게 된다.

  3) 변형프리온 검출을 위한 면역조직화학염색법(Imm-unohistochemistry)
  진단할 뇌 및 편도 조직의 무게를 재어 5 mM MgCl2가 포함된 TH 완충용액과 조직 무게와 동량의 sea sand를 첨가하여 -70℃에서 10-20분간 두어 얼린 후 녹이면서 균질화시킨다. 만약 조직의 양이 적을 경우에는 초음파파쇄기(sonicator)를 이용하여 균질화시킬 수도 있다. 균질화된 시료에 DNase I을 40 ㎕/100 mg 조직이 되게 첨가하여 1 시간동안  37℃에서 반응시키고 다시 조직 무게의 두 배가   되게 25% sarkosyl을 첨가한 후 상온에서 30분간 반응시킨다. 그 후 상온에서 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 취해 조직 무게와 동량의 NaCl을 첨가한 후 4℃에 16시간 동안 놓아둔다.   이 시료를 15,000 rpm으로 4℃에서 40분간 원심 분리하여 생긴 침전물에 완충용액 40 ㎕을 첨가하여 초음파파쇄로 균질화시킨 후, 단백분해효소로 37℃에서 30분간 처리한다. 그 후 2.5배 부피의 에탄올을
첨가하여 13,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리를 실시한다. 이렇게 얻어진 침전된 프리온 단백 분획에 전기영동의 표본완충액을 첨가하여 100℃에서 5분간 끓여 준비한다. 위와 같이 준비된 시료는 전기 영동하여 웨스턴 블롯법으로 확인한다[8].

  2. CJD 의심환자 검체 진단의뢰 및 시험성적 절차
  일반검사는 「크로이츠펠트-야콥병 및 변종크로이츠펠트-야콥병 관리지침」의 ‘검사의뢰서 및 환자 조사서’를 작성하여 검체와 함께 질병관리본부 신경계바이러스과로 의뢰한다. 검체가 도착하면 먼저   국립보건연구원 「진단검체 접수처」에서 실험실 진단시스템에 등록 후 실험실 담당자에게 전달되고, 검체 처리와 진단실험은 생물안전 3등급 실험실에서 진행된다. 뇌척수액 검체는 최소한 4 ml 이상 채취하며 cryogenic vial 튜브에 넣어 -20℃ 이하 냉동보관하고 4℃ 로 유지하여 운반해야 한다. 이 검체는 지표단백질을 검출하는데 사용될 검체이기 때문에 유리재질의 튜브는 사용해서는 안된다.
  혈액 검체는 항응고제 처리 튜브에 최소한 5 ml 이상 채취하고, 4℃ 이하 냉장보관 상태로 적혈구가 터지지 않도록 주의하여 하여야 한다. 소변검체는 중간뇨 30 ml 정도를 살균된 용기에 담아 -20℃에서 냉동 보관 이후 운반되어야 하며 채취 후 가능한 빠른 시간 내에 냉장 수송하여야 한다. 검체 및 수송방법은 해당의료기관의 수송방법(직접운송 또는 수탁검사기관의뢰)을 따르지만 검체 특성상 3중  밀폐 용기사용을 권장하고 있으며 전문포장용기는 신경계바이러스과에서 제공하고 있다(Figure 2).   실험실 진단결과통보는 검체 접수 후 21일 내에 각 의료기관으로 우편 발송으로 통보하고 있다.

                             
  조직병리학적 검사를 위한 뇌조직 검체는 검사의뢰서 및 환자조사서를 작성하여 한림대 진단협력센터에 검사를 의뢰한다. 검사결과는 검사의뢰기관과 질병관리본부 전염병관리과에 통보하고 뇌조직은 신경계바이러스과에 보관하도록 규정하고 있다.

  3. 국립보건연구원 CJD 실험실 진단 현황(2005-2010년도)
  CJD가 2001년 법정전염병으로 지정되고 2005년도 CJD 전용 생물안전3등급 실험실이 설치된 이후 현재까지 신경과가 개설되어 있는 표본감시의료기관으로부터 의뢰되는 CJD 의심환자군을 대상으로 지표단백질 검출과 프리온 유전자형 분석을 위한 실험실 진단을 수행해 오고 있다. 2005년부터 현재까지 진단 의뢰된 월별 검체 현황은 Table 2와 같다. 59개 의료기관에서 총 327건이 의뢰되었고 이 가운데 분당서울대병원, 경북대병원과 중앙대병원 등에서 가장 많이 의뢰되었는데 이는 신경과 전문의의 CJD에 대한 인식과 이해도와 관련이 있는 것으로 사료된다. 검사항목별 진단결과를 볼 때, 14-3-3 단백 양성률이 50% 이상으로 나타났고, 프리온 단백질 129번 코돈 M/M형이 95% 이상으로 높게 나타났다(Table 3). 이외에도 유전자 분석 결과에서 129번 코돈 외에 유전성 CJD와 병원성 유전형 지표인자로 알려진 다른 다형성 인자들이 10여개 확인되었다(Table 4).
                        

  4. CJD 의사환자 감시 및 보고체계
  질병관리본부 신경계바이러스과의 실험실 진단결과와 의료기관의 임상진단결과를 종합하여 크로이츠펠트-야콥병이 의심되는 환자가 있는 경우 담당 주치의는 「감염병 발생 신고(변경신고·보고)」(별지 제1호서식)를 작성하여 의료기관 소재지 관할 보건소장에게 즉시 신고하여야 한다. 또한 중앙 또는 시도 역학조사관의 사례조사에 협조해야 한다. 사례조사 결과를 바탕으로 질병관리본부 관계공무원, 연구기관과 의료기관의 전문가들로 구성된 CJD/vCJD 감시평가위원회의 평가 및 자문을 거쳐 부검을 권고하고, 환자 판정을 확인한다(Table 5). 생검이 필요하다고 판정한 경우 한림대 부검센터에 ‘생검키트 요청서’를   제출하여 생검키트를 제공 받은 후 검체를 채취하여 부검센터로 검사를 의뢰하여야 하며 부검을 의뢰할 경우에는 보호자 동의를 받은 후 ‘부검의뢰서’와 함께 사체를 부검센터로 이송하여야 한다.


  5. 크로이츠펠트-야콥병 환자 능동적 감시체계 사업 소개
  질병관리본부에서는 2010년부터 국내 프리온 질환(CJD 및 vCJD) 위기대응기술 개발연구 일환으로 「국내 크로이츠펠트-야콥병 환자에 대한 능동적 환자 감시체계」에 대한 연구용역사업을 수행하고   있다. 본 과제는 국내에서 보고된 CJD 의심환자를 대상으로 발생부터 질병의 진행단계별, 그리고 사망까지 추적함으로써, 크로이츠펠트-야콥병 국내 감시시스템을 구성하고 이를 통해 향후 국내 발생 크로이츠펠트-야콥병 환자의 자료 수집 및 분석을 용이하게 하며 또한 현재까지 밝혀진 외국 통계와의 비교를 통해 국내 실정을 파악하고 현재 통용되는 크로이츠펠트-야곱병 진단기준을 보다 유효성있게 개정함을 목적으로 한다.
  sCJD의 경우 그 원인으로 알려진 프리온이 일상적인 소독절차에 의해서는 감염성이 줄지 않기 때문에 환자의 혈액이나, 의학적 검사 및 치료 도구에 의한 재감염의 위험성이 높으나 국내에서는 정확한 발생률에 대한 자료가 아직 없고, 국내에서 발생하는 CJD를 경계할 수 있는 시스템이 없는 실정이다. 따라서 국내에서 발생하는 CJD에 의한 2차 감염의 위험성에 대한 대비가 충분치 못하고 만일 국내에서 vCJD가 발생해도 이를 조기에 파악하여 대책을 세우기가 어려울 것으로 판단된다.
  국내 sCJD의 정확한 발생빈도와 그 경과에 대한 자료수집 및 환자의 진단 및 치료에 대한 지침을  마련함으로써 국내 sCJD 환자에 대한 대책을 수립하는 가장 기본적인 정보를 제공할 수 있으며, 또한 국내 CJD 환자의 관리시스템을 통해 국내 vCJD의 유무를 파악하고 국내 현황에 대한 명확한 자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 외국에서도 긴 잠복기와 젊은층에서 발생하는 사례들이 포함되지 않는 경우가 있어 진단의 민감도와 특이도가 저하되는 한계를 극복하지 못하고 있으므로, 국내 발생률에 대한 전향적 조사와 유병 및 생존기간의 철저한 조사를 통해 이러한 한계점을 동시에 해결할 수 있을 것으로 생각된다. 또 위의 연구 목적들은 개인의 연구로 파악될 수 있는 것들이 아니고, 오랜 시간에  걸쳐 조직적인 연구와 전국적인 조사가 필요하므로 국가주도의 예비연구가 우선 진행되어야 한다.
  이를 위한 연구 방향의 하나로 현재 CJD의 진단에 가장 유용하게 사용되고 있는 14-3-3 단백검사에 대한 현황과 그 검사를 의뢰받았던 환자에 대한 6개월 추적조사를 통해 국내 CJD 환자의 진단에 대한 국내 의료진의 이용도와 추적검사 결과를 추가로 제시할 예정이다. 이와 더불어 점차 조기 진단으로써 그 유용성이 강조되고 있는 MRI 검사를 시행하여 진단기준에 MRI 검사를 포함시 것이 민감도와 특이도를 얼마나 향상시킬 수 있는지에 대한 비교 연구를 하고자 한다.

 ■ 연구수행체계
  1. 국내 CJD 환자 발생 감시체계 수립
   ① Korean CJD surveillance unit의 구성
   ② CJD 의심환자를 본 연구에 위탁하기 용이한 전국적 network 수립
   ③ 위탁시 필요한 각종 동의서 제작
      ㄱ) 14-3-3 단백 검사 동의서
      ㄴ) 그 외 필요에 의한 혈청 및 뇌척수액 검사 동의서 및 수집 동의서
     MRI 수집 동의서
   ④ CJD 환자 조사표 제작
   ⑤ CJD 환자의 자료 수집

  2. 국내 CJD 환자의 임상 특성 분석
   ① 연간 발생률, 발생 연령, 성별, 지역, 직업군에 따른 발병 차이, 초기 증상
   ② 확진 전까지의 의료서비스 실태
   ③ 진단 후 병의 경과
   ④ 각 단계별 경과 시간 및 임상 특성
   ⑤ 생존기간의 외국 보고와의 비교 및 그로 인한 경제, 사회, 국가적 비용 부담 추정

  3. 조기 검사 후 추적 조사
   ① 14-3-3 단백검사에서 양성이었던 환자들의 6개월 추적 관찰 후
      ㄱ) CJD 확진률
      ㄴ) 다른 질환으로 판명시 질환의 종류 및 그 비율 분석
      ㄷ) 다른 질환과의 감별에 도움이 될 검사들이나 증상들을 전향 조사
      ㄹ) 특히 치료 가능한 질환의 detection 및 조기 치료 유도
   ② MRI 검사에서 양성이었던 환자들의 6개월 추적 관찰 후 상기 ㄱ) - ㄹ) 추적 조사
   ③ MRI 검사에서 음성이었던 환자들의 6개월 추적 관찰 후
      ㄱ) CJD 확진률
      ㄴ) 다른 질환 확진률  

  4. CJD의 임상단계의 설정 및 진단법 개발
   ① Consensus staging guideline
   ② 임상단계에 따른 증상 및 검사 특성
   ③ 진단 방법의 개발
   ④ 진단 기준의 확립
      ㄱ) 국내 실정에 맞는 진단 기준 확립
      ㄴ) (임상 증상 + 14-3-3 단백), (임상 증상 + 뇌파), (임상 증상 + MRI), (임상 증상 + 14-3-3 단백 + 뇌파), (임상 증상 + 뇌파 + MRI)등
           어떤 검사들의 결합이 진단의 정확성과 유효성을 높이는지 비교, 분석

  5. CJD 환자의 혈액 및 CSF bank
 

            Source : 2010년 국내크로이츠펠트-야콥병 환자에 대한 능동적 환자 감시체계 계획서, 질병관리본부


Ⅲ. 맺는 말


  사람의 프리온 질환인 크로이츠펠트-야콥병 중 광우병소고기 섭식이 원인으로 알려진 인간광우병(vCJD)이 영국의 젊은 층에서 발병 보고된 이후 유럽전역으로 확대되면서 이에 대한 공포가 전세계적으로 확대되었다. 국내에서도 2008년 광우병 발생국에서의 소고기 수입개방이 정책화되고 이에 대한  사회적 불안감이 커지면서 vCJD를 비롯해 그동안 희귀질환으로 알려져 환자보고가 적었던 CJD에 대한 관심이 증폭되었다. 아직까지도 이에 대한 정확한 정보가 없는 상황이고 발병이 개인 잠복기에 따라  차이가 있는 것으로 알려져 있기 때문에 질병에 대한 많은 홍보와 국내외 연구 협조가 필요하다고 하겠다[9].
  정부에서도 CJD와 vCJD의 국민적 관심과 국가 차원의 위기대응 정책 강화의 필요성이 반영되어, 2009년에 병인기전 및 치료제 개발 관련한 기초연구가 기획되어 2010년부터 관련 연구개발 사업이  진행되어 오고 있다. 이 질환의 병리기전에 대한 연구는 현재 진행 상태이며 아직 원인병원체 규명과 전파 감염 등 규명해야할 부분이 많이 남아 있다. 현재 실험실 진단은 WHO 기준에 근거하여 진행되고 있으나, 환자 확진을 위해서는 반드시 뇌부검을 실시해야 함에도 불구하고 국내 여건상 어려움이 많아 이에 대한 국내 자료는 없는 실정이다[10].
  더욱이 CJD가 발생률은 적어도, 국민 건강에 미치는 영향이 매우 크다고 평가되고 있음에도 전체   발생률과 감시 보고체계는 체계적으로 이루어지지 못하고 있다.
  CJD가 알쯔하이머병이나 파킨슨병과 같이 단백질의 응축으로 아밀로이드를 생성하여 뇌에 축적함으로써 신경퇴행에 영향을 미치며 또한 프리온 단백이 상기 퇴행성 뇌질환의 발병에 영향을 미친다는   보고가 있어 환자 감시를 하거나 병인기작연구를 수행할 때, 기존의 타 퇴행성뇌질환 분석결과와 비교하여 상호 연관성 연구를 수행해 오고 있다[11, 12]. 국내에서도 치료가 어려운 퇴행성신경질환들에  대한 다양한 접근을 통해 원인체에 대한 이해도를 높이고 이러한 분석결과를 통해 CJD의 발병원인을 밝혀나가는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
  결론적으로 국민의 사회적 불안감 해소와 국가 보건 의료 분야 경제적 손실을 최소화하기 위해 국가차원의 적절한 제도와 다양한 의료시설에 대한 장치를 마련하여 인간광우병 환자의 발생을 최소화하도록 임상연구자와 기초연구자는 협조하여 조기 진단 및 예방, 치료제개발 연구에 참여하여야 할 것이다. 또한, 환자 및 환자 가족들에게는 감염성 및 유전성에 대한 질병의 정확한 정보를 홍보하여 이해를   돕도록 표준화된 예방관리 대책을 수립해야 할 것으로 사료된다.

Ⅳ. 참고문헌

1. William A. Rutala, David J. Weber. Creutzfeldt-Jakob Disease: Recommendations for Disinfection and Sterilization. Clinical Infectious Diseases 2001; 32: 1348-1356. 
2. Prusiner SB. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95(7):13363-83.
3. CDC. World Health Organization consultation on public health issues related to bovine spongiform encephalopathy and the emergence of a new variant of Creutzfeldt-Jakob disease. MMWR 1996; 45: 295-6, 303.
4. Collinge J: Prion diseases of humans and animals: their causes and molecular basis. Annu Rev Neurosci 2001, 24:519-550.
5. Prusiner SB and DeArmond SJ. Prion diseases and neurodegeneration. Ann. Rev. Neuroscience. 1994; 17:311-339.
6. Collie DA, Sellar RJ,  Zeidler M, Colchester ACF, Knight R and  Will RG.  MRI of Creutzfeldt Jakob Disease: Imaging Features and Recommended MRI Protocol. Clinical Radiology 2001; 56(9): 726-736.
7. WHO. WHO infection control guidelines for transmissible spongiform encephalopathies. Report of a WHO consultation; 1999 Mar83-26; Geneva. Geneva: The Organization; 1999.
8. Sasaki A, Hirato J, Nakaxato Y. Immunohistochemical study of microglia in the Creutzfeldt-Jakob diseased brain. Acta Neuropathol 1993; 86
9. 김기홍. 광우병논쟁, 2009. 300pp. 해나무출판사
10. Iwasaki Y. Mimuro M, Yoshida M, Sobue G and Hashimwme Y. Clinical diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease: Accuracy based on analysis of autopsy-confirmed cases. Jr. Neurol. Sci. 2009; 277: 119-123.
11. Olanow CW and Prusiner SB. Is Parkinson's disease a prion disorder?  PNAS 2009; 106(31): 12571-12572.
12. Valayos JL, Irujo A,Cuadrao-Tehedor M, Paternain B, Moleres FJ, and Ferrer V. The cellular prion protein and its role in Alzhimer disease. Prion 2009; 3(2): 110-117.

 

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