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의생물학연구에서 차세대 서열확인법과 엑솜 서열확인법의 역할
  • 작성일2011-02-11
  • 최종수정일2012-08-25
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7173

     

의생물학연구에서 차세대 서열확인법과 엑솜 서열확인법의 역할
Role of next generation sequencing and exome sequencing in biomedical research

질병관리본부 유전체센터 바이오과학정보과         
조성범        
  


Ⅰ. 들어가는 말
  인간유전체서열의 초안이 완성된 이후, 의생물학 분야에서 유전체에 관한 연구가 차지하는 비중은  매우 높아졌다. 마이크로어레이(microarray) 1)와 같은 높은 처리용량을 가지는 기법(high throughput technology)의 비약적인 발전으로 대용량의 자료가 한 번의 실험으로 손쉽게 얻을 수 있는 환경이 구축되면서 유전체학적인 연구방법이 의생물학 연구에서 더욱 중요한 위치를 차지하게 되었다. 최근에는  유전체의 서열이나 발현정보를 빠른 시간 안에 직접 확인할 수 있는 차세대 서열확인법(Next Generation Sequencing: NGS)이 발전하면서 의생명과학의 연구에서 중요한 도구로 자리를 잡고 있다. 이 글에서는 차세대 서열확인법의 개요와 응용분야를 살펴보고, 희귀질환에 관한 연구에서 활발히 진행되고 있는 엑솜 2)서열확인법(exome sequencing)에 대해서 살펴보려고 한다.


Ⅱ. 몸 말
  DNA 서열을 확인하는 방법(sequencing)은 1977년에 Sanger 등의 연구에 의해서 개량된 이후에 많은 발전을 이루었다. 기계의 자동화와 생물정보학의 발전, 그리고 컴퓨터 과학의 발전과 더불어 서열확인법도 계속 발전하였다. 현재 가장 진보한 형태의 서열확인법은 차세대 서열확인법(Next Generation Sequencing: NGS)이다. 이 방법은 기존의 모세관 서열확인법(capillary sequencing)에 비해서 빠르면서 한 번에 더 은 양의 서열확인을 수행할 수 있고, 기존의 모세관 서열확인법에서 사용하는 벡터를   이용한 시료의 증폭 과정이 생략되기 때문에 이 과정에서 발생하는 실험적인 오류를 피할 수 있다는  장점을 가지고 있다.
  현재 3곳의 회사에서 제작한 NGS 시스템이 주로 사용되고 있다[1]. 2004년에 출시된 Roche사의 454 GS FLX는 처음 소개된 NGS 장비였다(Figure 1). 이 장치는 pyrosequencing 방법과 유화제-중합효소반응(emulsion-polymerase chain reaction)을 사용하여 서열확인을 수행하고, 실험의 최종단계에서 나오는 빛의 세기에 따라서 특정 염기를 확인할 수 있다. 7시간 가동시켰을 때 100Mb 정도의 서열을 확인할 수 있는데, 기존의 ABI 3730 기기가 같은 시간에 440kb의 서열을 확인할 수 있는 것에 비해서 월등히 높은 성능을 나타낸다. Illumina 사의 Illimina Genome Analyzer는 합성에 의한 서열확인(sequencing by synthesis)이라는 개념을 도입하였다(Figure 2). 이 방법은 유리판 위에 한 가닥만으로 이루어진 DNA 조각을 부착한 후에, 이 조각들을 중합반응을 거쳐서 군집(cluster)을 이루게 한다.    이 과정을 거칠 때 검사하려는 DNA 조각에 붙은 염기의 종류를 확인하면서 서열확인법을 수행하는데, 약 4 일 정도의 작업으로 32-40 개의 염기길이를 가지는 단편이 4-5천만 개가 생산이 된다. Life Technologies 사의 SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation) 기기는 2007년에 출시되었다. 이 장비는 1 μm 크기의 자성 구슬에 검사하려는 DNA 조각을 부착시킨 후에 유화제-중합효소연쇄반응을 이용하여 서열확인을 수행한다. 서열확인을 할 때는 8-mer의 단편들을 반복해서 붙이는 방식을 사용하는데, 이 8-mer의 4, 5번째에 실제 서열확인에 사용될 염기가 위치하고 있다. 그 뒤에 붙은 나머지 부위에는  형광물질이 연결되어 있어서 어느 염기가 검사하려는 DNA 조각에 상보적으로 결합하는 지를 표시해 준다. 한 번의 결합 주기마다 8-mer를 모두 5번 붙이고, 같은 작업을 5번 시행하면 총 25염기로 이루어진 DNA 조각의 서열을 확인할 수 있다. SOLiD 기기의 특징은 두 개의 염기를 이용한(two-base encoding) 서열확인이다(Figure 3). 이 방법은 하나의 염기의 서열을 결정할 때 같은 부위를 두 번의 서열확인을 통해서 확인하는 방법으로, 자성구슬에 부착된 부착제(adaptor)쪽으로 한번의 결합 주기마다 한 염기씩 서열을 이동시키면서 서열확인을 수행하는 방법이다. 이 과정을 통해서 서열확인실험에서  발생하는 오류를 제거할 수 있는 장점이 있다.

                               

  최근에 NGS 기술은 의생물학 연구에서 돌연변이 발견, 환경유전체학(metagenomics), 병원체 연구, DNA-단백질 결합 연구 및 mRNA 발현 연구에 다양하게 응용되고 있다[2]. 먼저, 서열 변이발견은 NGS 기술이 많이 적용되는 분야이다. NGS 기술은 기존의 모세관 서열확인법에 비해서 더 높은 민감도를 가지고 있어서 유전질환의 희귀변이(rare variant)의 발견에 많이 사용되고 있다. 최근에는 진료환경에서 채취한 환자의 검체에서 각종 미생물의 검출에도 사용되고 있다. 이러한 경우, NGS 기술의 특성상   벡터를 이용한 증폭과정이 필요하지 않기 때문에 증폭에 관련된 실험과정에서 발생하는 오염을 피할 수 있는 이점이 있다. 외부환경에서 검체를 채취한 후에 존재하는 미생물을 연구하는 환경유전체학에도 NGS 기술이 적용되고 있다. 또한, 외부환경뿐만 아니라 인간에 상재하는 여러 미생물의 동정에도 응용되고 있다. DNA와 단백질의 결합에 관한 연구에서는 단백질-전사조절인자나 히스톤-이 유전체의 특정 서열에 결합된 부위를 NGS를 이용한 서열확인법으로 파악하는 방식이 많이 쓰이고 있다. 이외에도   전사체(tranome) 및 microRNA의 연구에서도 NGS가 이용되고 있다.
  NGS기술의 응용분야 중에서 유전체의 단백질 발현부위만을 서열확인하는 엑솜 서열확인(exome sequencing)은 질병연구에서 많은 응용이 기대되는 분야이다[3]. 인간의 엑솜은 전체 유전자의 1%를 차지하고 있는데, 대부분의 유전질환이 단백질 발현 유전자의 이상에 의해 발생하므로 엑솜 연구는   유전질환의 연구에 있어 매우 중요한 방법론이다. 현재 의학 유전학 분야에서 엑솜 서열확인은 주로  희귀한 유전질환의 연구에 적용되고 있다. 다음에 열거하는 사례들은 엑솜 서열확인을 통하여 휘귀질환의 발병에 관여하는 유전적 변이를 발굴한 연구들이다. 2009년에 Ng 등은 12명의 인간 엑솜에 대한 서열확인의 결과를 발표하였다[3]. 그 중에서 8명은 HapMap 프로젝트에서 제공하는 정상인의 엑솜이었고, 4명은 희귀질환의 일종인 Freeman-Sheldon syndrome(FSS)환자의 엑솜이었다. 이 연구에서 저자들은 정상인에게서 발견되지 않는 2개의 SNP를 FSS환자에서 발견하였다. 2010년에는 같은 연구실에서 멘델성 유전질환인 밀러증후군(Miller syndrome)을 유발할 수 있는 후보유전자인 DHODH(dihydroorotate dehydrogenase)의 유전적변이를 동일한 방법을 이용하여 발견하였다(Figure 4) [4].
  그 외에도 몇 몇 연구자들이 엑솜 서열확인법을 이용하여 희귀 질환을 일으키는 원인이 될 수 있는 유전적 변이를 발굴하였다. Musunuru등은 2010년에 기존에 알려진 APOB(apolipoprotein B)의 변이가 없는 가족성 저베타지질단백질의 환자에서 ANGPTL(angiopoietin-like 3 protein)유전자의 돌연변이를 발견하였다[5]. Haack등은 엑솜서열확인을 통해서 미토콘드리아 질환의 원인유전자인 ACAD9(acyl-CoA dehydrogenase family, member 9)의 돌연변이를 확인하였다[6]. Bilguvar등은  심각한 발달성 뇌병변을 보이는 유전질환에 연관된 WDR62(WD repeat domain 62)의 열성 변이를   보고하였다[7].
                               

  엑솜서열확인은 유전성 희귀질환의 연구뿐만 아니라 암의 연구에도 적용되고 있다. Ley등은 2008년에 세포유전학적으로 정상인 급성 골수성 백혈병환자의 시료를 엑솜서열확인을 통하여 검사한 결과, 10개의 암특이적인 돌연변이를 발견하였다[8]. Harbour 등은 BAP1(BRCA1-associated protein 1)의 돌연  변이가 포도막 흑색종의 전이와 연관이 있음을 엑솜서열확인을 통해서 밝혔다[9].

Ⅲ. 맺는 말


  현재 발전하고 있는 NGS 기술은 서열에 관한 정보를 기존의 방법보다 더욱 직접적이고 효율적으로 획득하게 된다는 점에서 그 의의가 크다. 다만, 방법의 신뢰도에 대해서는 지속적인 검증이 필요할 것이다. 그 외에도 높은 실험비용 때문에 연구에 적용하는 데에 어려움이 있는데, 이 문제는 시간이 지나면서 해결될 것으로 보인다. 의과학연구에서 기존에 사용하던 방법론과 더불어 빠른 시일 안에 차세대 서열확인법이 기본적인 유전체 연구방법으로 자리 잡게 될 것이다.


                                                                                                                                                                                          

1) 마이크로어레이(microarray) : 슬라이드글라스에 한번에 유전체 전역의 변이 혹은 발현 정보를 검출하는 연구방법
2) 엑솜(exome): 생명의 유전 정보 전체세트는 유전자(gene), 또는 유전정보의 전체라는 의미에서 게놈(genome)이라고 부르는데, 게놈의 유전자 안에 있는 단백질 서열이 되는 부분인 모든 exon을 가리키는 새로운 생물학 용어로 엑솜이 등장함


Ⅳ. 참고문헌

1. Mardis ER. The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends Genet. 2008 Mar;24(3):133-41.
2. Teer JK, Mullikin JC. Exome sequencing: the sweet spot before whole genomes. Hum Mol Genet. 2010 Oct 15;19(R2):R145-51.
3. Ng SB et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 2009 Sep 10;461(7261):272-6.
4. Ng SB et al. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder. Nat Genet. 2010 Jan;42(1):30-5.
5. Musunuru et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia. N Engl J Med. 2010 Dec 2;363(23):2220-7.
6. Haack et al. Exome sequencing identifies ACAD9 mutations as a cause of complex I deficiency Nat Genet. 2010 Dec;42(12):1131-4.
7. Bilguvar et al. Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations. Nature. 2010 Sep 9;467(7312):207-10.
8. Ley et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. Nature. 2008 Nov 6;456(7218):66-72.
9. Harbour et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 2010 Dec 3;330(6009):1410-3.

 
 

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