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암 진단을 위한 유전자검사로서 DNA 메틸화 검사
  • 작성일2011-08-05
  • 최종수정일2012-08-24
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7173

     

암 진단을 위한 유전자검사로서 DNA 메틸화 검사
DNA methylation test for detection or prognosis of cancer as a genetic testing

질병관리본부 국립보건연구원 생명의과학센터 생명과학연구관리과           
염정원, 이대연, 김용우           

  


Ⅰ. 들어가는 말
  암은 우리나라 뿐만 아니라 전 세계에서 가장 높은 사망원인 중 하나 1)로서, 조기진단 여부에 따라 완치율이 결정되는 경우가 많아 건강검진 등을 통한 암의 조기진단이 중요하게 여겨지고 있다. 일반적으로 건강검진 시 많이 이용되는 암 검사는 혈액 내 단백질 종양 표지자(marker) 검사이며, 그 밖에  내시경, 조직검사 등을 통해 암 발생 여부를 확인할 수 있다.
  이 글에서는 최근 암 진단을 위한 유전자검사 방법으로 개발되고 있는 DNA 메틸화(methylation)   측정의 원리와 기술에 대한 최근 자료를 바탕으로 현재 기술 현황을 파악하고, DNA 메틸화 유전자검사의 효용성 및 앞으로의 가능성에 대한 정보를 제공하고자 한다.
  DNA 메틸화는 유전체에 일어나는 가장 대표적인 후성적인 변화(epigenetic change)로서, 암 조직에서 DNA의 후성적 변화를 측정하는 것은 암의 조기 진단, 예후, 약물 반응성 예측을 위한 새로운 표지자로서 기존의 암 검사를 보완할 수 있는 좋은 도구가 될 수 있을 것이다.


Ⅱ. 몸 말
  1. 암과 DNA 메틸화의 관계
  암을 일으키는 유전체의 비정상적인 변이에는 3 종류가 알려져 있는데, 염색체의 일부분이 통째로  바뀌거나, 염기서열이 1-2 군데 바뀌는 염색체의 순서나 염기서열의 변화 외에 염색질의 변화(chromatin modification)인 후성적 변화가 그 원인일 수 있다[1]. 일반적으로 염색체의 일부 또는   몇 군데가 바뀌는 변이는 유전적(genetic) 원인일 수 있으며, 방사선 등 돌연변이 유발요인에 의해 체세포에서 국소적으로 일어날 수도 있다. 후성적 유전체 변화 중에서 가장 대표적인 암 세포에서의 DNA 메틸화 변화는 정확한 원인이 밝혀져 있지는 않지만 식생활이나 환경적 요인이 그 원인일 것으로 생각되고 있다[2]. 특히 이러한 후성적 유전체 변화는 암이 발생한 조직의 유전체에서 많이 발견되고 있어 이를 이용한 진단법 개발 등의 임상적용에 대한 관심이 높아지고 있다.
  DNA 메틸화는 cytosine pyrimidine 링의 5번째 탄소에 메틸기(CH3)가 공유결합으로 첨가되는 현상이다. DNA 메틸화는 정상적인 개체의 발생에서도 genomic imprinting, X-chromosome inactivation 등 다양한 생명현상에서 중요한 역할을 하고 있다.
  암 조직에서는 정상 세포와는 다른 두 종류의 DNA 메틸화 현상이 나타나는데, 유전체 전반에 걸친 저메틸화(hypomethylation) 현상과 유전자 발현 조절부위(promoter)에 위치한 CpG island의 고메틸화(hypermethylation) 현상이 그것이다. 저메틸화 현상은 주로 유전자와 유전자 사이 지역(intergenic region)에서 나타나며, 이는 염색체를 불안정하게 만들어 세포분열 과정에서 염색체의 재조합(recombination), 전이(translocation), 절단(deletion), 재배열(rearrangement) 등을 일으키는 것으로 추측되고 있다[1, 3]. 이러한 암 조직에서의 DNA 메틸화 변화는 유전적(genetic)이라기보다는 후성적(epigenetic)인 것으로 여겨지고 있다. 이러한 후성적인 변화는 세포 분열 이후에도 유지되기 때문에 CpG island의 고메틸화는 그 주변에 위치한 유전자의 발현을 지속적으로 억제하게 된다. 실제로 암   억제유전자(tumor suppressor), 세포주기조절(cell cycle) 유전자, DNA 수리(repair) 관련 유전자, 세포 접착(adhesion) 관련 유전자 등이 암 조직에서 DNA 메틸화에 의해 발현이 억제됨으로써 이들 유전자가 고장 난 것과 같은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다[3]. 이러한 유전자들의 발현이 억제됨으로써 세포는 비정상적으로 증식하며, 유전적 안정성을 유지하지 못하게 되어 추가적인 돌연변이를 유발하여 암을 진행시키는데 중요한 역할을 하게 된다.

  2. DNA 메틸화 검사방법
  조직의 DNA 메틸화를 알아보는 방법은 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)을 이용하는 방법과 5-methylcytosine에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody) 등 항체를 이용하는 방법이 있다. 현재까지 진단목적의 DNA 메틸화 검사는 대부분 아황산수소나트륨과 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하는 방법이 주로 이용되고 있다. 아황산수소나트륨을 DNA에 처리하면 메틸화되어 있지 않은 cytosine(C)이 uracil(U)로 바뀌는 화학적 특성을 이용한 방법이다. 아황산수소나트륨을 DNA에 처리한 후 메틸화 특이적인 PCR(methylation-specific PCR, MSP)을 수행하거나 해당 부분에 대한 염기서열분석을 통해 메틸화 여부를 확인할 수 있다. 일반적으로 암 조직에서 특이적으로 DNA 메틸화가 일어나는 것으로 많이 알려진 p16INK4A, RASSF1A, DAPK11, GST1, CDH1, RAR-β, APC, BRCA1, p14ARF 등의 유전자에서 DNA 메틸화 변화를 측정하는 연구는 대부분 MSP 방법을 이용하여 진행되어 왔다[4]. MSP나 메틸화 염기서열 분석 방법 외에 좀 더 많은 부위의 메틸화 여부를 측정하기 위한 multiplexed primer extension assay 등의 방법도 있지만, 이러한 방법들은 일반적으로 특정부분만의 메틸화를 측정할 수 밖에 없다는 한계가 있다. 최근에는 이러한 한계를 극복하기 위하여 전장유전체(whole genome) 수준에서 메틸화를 측정할 수 있도록 차세대 염기서열(next generation sequencing, NGS)분석을 이용한 방법들이 개발되고 있다. 이를 위하여 최근까지 개발된 NGS 플랫폼은 Table 1과 같다[5]. 이들 방법의 공통점은 DNA를 특정 표면 또는 지지대에 고정시킨 후 하나의 DNA 분자 또는 증폭된 DNA templates에 대해 한 번에 수천에서 수십억 염기를 읽을 수 있다는 점이다. 이러한 기술은 분석 비용을 낮출 뿐만 아니라, 짧은 시간에 높은 정확도(single base resolution)로 전장 유전체의 DNA 메틸화 정보를 얻을 수 있도록 해준다.

  3. 체액에서의 DNA 메틸화 분석
  체액에 있는 DNA를 이용하여 진단하는 것은 암 환자로부터 해당 조직을 채취하여 검사하는 것에 비해 비침습적(non-invasive)으로 검체를 채취할 수 있기 때문에 혈액 등 체액에서 DNA 메틸화 검사를 하는 방법들이 개발되고 있다[4]. 혈청 또는 혈장 내 DNA는 괴사성(necrotic) 세포 또는 세포소멸(apoptosis)로부터 유래하기 때문에 DNA 메틸화와 같은 암 특이적인 진단에 이용될 수 있다고 생각되어져 왔다[6]. 혈장 외에도 폐암의 경우 가래, 전립선암의 경우 소변, 대장암의 경우 대변, 유방암의  경우 유두 흡입물(nipple aspirates)에서 DNA 메틸화 검사는 42-87%의 감도를 가지고 64-100% 암 특이적 DNA 메틸화를 검사할 수 있는 것으로 보고되고 있다[3]. 고속대용량(high-throughput) DNA 메틸화 검사를 통해 선별한 표지자들을 조합하여 검사를 실시한 결과, 초기 단계의 유방암 환자를 포함하여 약 90% 정도의 유방암 환자를 혈장 내 DNA 메틸화 검사로 구별할 수 있었다[7]. 특히, GSTP1 유전자의 발현조절부위(promoter)의 고메틸화는 50세 이상의 환자에서 높은 연관성을 보였으며, P16 유전자의 고메틸화는 암의 초기단계와 연관성을 보였고, BMB6 유전자의 고메틸화는 임파선(lymph node)과의 연관성을 보였다.

  4. DNA 메틸화 암 유전자검사 현황
  전 세계적으로 DNA 메틸화 검사를 이용한 암 진단은 대부분 아직 연구단계로 여러 가지 암의 조직 또는 체액에서 DNA 메틸화와 암 진행 상태간의 연관성을 히는 연구와 그 정확성 등에 대한 평가가 활발히 이루어지고 있는 것으로 보인다. 현재까지 몇 가지 DNA 메틸화 측정법은 암 진단에 있어 추가적인 보조 수단으로서, 그리고 암 환자의 맞춤형 약물 치료를 위한 검사로서 개발되고 있다(Table 2).

  국내에서 지금까지 검사방법에 대해 유효성이 인정되어 보험코드가 정해져 있는 DNA 메틸화 검사는 MGMT 유전자 메틸화 검사 등 2종류이며, 현재까지 신의료기술평가(nHTA) 2)에 신청된 3종류의 DNA 메틸화 검사 중 암 진단 등을 위한 2종류의 검사법에 대한 평가가 진행 중이다(Table 3). 현재 국내에서 암 검사 등을 목적으로 이러한 DNA 메틸화 검사를 실시하고 있는 유전자검사기관은 서울대학교  병원 등 9곳 정도가 있다(Table 3).


Ⅲ. 맺는 말


  암과 DNA 메틸화의 연관성에 대한 최근의 연구결과들은 DNA 메틸화 정도를 측정하여 암을 조기에 진단하거나, 수술 후 암의 진행양상을 예측하고, 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 유전자검사로서 임상에 적용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 그리고 실제로 가래, 혈장, 대변, 소변, 유두 흡입물 등의 체액에서 DNA 메틸화 표지자(molecular marker)를 이용한 암 진단 가능성에 대한 평가연구가 진행되고 있다[3]. 하지만 많은 연구 성과에도 불구하고 아직은 몇 가지 제한점들로 인해 이러한 DNA 메틸화 검사가 일반적인 암 검사에 널리 이용되고 있지는 않다. 그 이유 중 하나는 많은 DNA 메틸화 후보 유전자들의 메틸화 빈도가 그리 높지 않아 일반적인 임상 검사로는 측정하기 어렵다는 점과 암 조직을 직접 이용했을 때는 잘 측정되는 검사법이 혈장 등의 체액을 이용하여 측정했을 때는 정확한 결과가 나오지 않는 경우가 많다는 점이다[3]. DNA 메틸화에 관한 것은 아니지만 유전체정보임상적용평가단(EGAPP Working Group, EWG) 3)에서 발표한 가이드라인에 따르면 유방암 환자에서 암 유전자 발현 프로파일링 검사가 환자의 치료에 도움이 되는지에 대해 아직 과학적 근거가 부족하다고 밝히고 있다[8]. 암 유전자 발현 검사는 DNA 메틸화에 의한 결과물을 측정하는 검사라고도 볼 수 있으므로, DNA 메틸화 검사결과만으로 암을 진단하거나 치료에 활용하기에는 아직 과학적 근거가 충분하지 않다고 할 수 있다.
  앞으로 차세대 전장 유전체 염기서열분석(next-generation whole genome sequencing) 등과 같이 많은 유전자 부위의 메틸화를 동시에 측정할 수 있는 방법을 이용하여 우수한 DNA 메틸화 표지자를 선별하고, 각 표지자와 암 발생과의 연관성을 평가할 수 있는 과학적 근거를 충분히 확보함과 동시에, 미량의 DNA 메틸화 변화를 임상수준에서 정확히 측정할 수 있는 기술의 개발을 통해 이러한 문제점들을 극복한다면, DNA 메틸화 검사는 맞춤형 진단 및 치료를 위한 좋은 도구가 될 수 있을 것이다. 그리고 이러한 새로운 측정방법과 장비를 이용하는 검사로부터 신뢰성 높은 진단결과를 얻기 위해서는 진단을 수행하는 유전자검사기관 검사실의 자체적인 정도관리 노력과 객관적인 평가가 지속적으로 이루어져야 할 것이다. 

                                                                                                                                                                                          

1) 통계청 자료에 따르면 우리나라에서 2009년에 약 7만 명이 암으로 사망하였음
2) 새로 개발된 의료기술의 건강보험요양급여 여 결정하기 위하여 안전성과 유효성에 대한 전문가 평가시스템
3) The EGAPP (Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention) Working Group : 미국 질병통제본부(CDC)의 지원을
    받아 유전자검사 또는 유전체 기술을 임상 또는 보건행위에 적용하는데 있어 체계적으로 근거 중심의 평가를 통해 가이드라인을 제시
    하는 전문가 그룹


Ⅳ. 참고문헌

1. Sticker T, Catenacci DV, Seiwert TY. Molecular profiling of cancer - the future of personalized cancer medicine: a primer on cancer biology and the tools necessary to bring molecular testing to the cllinic. Semin Oncol 2011 38(2): 173-85.
2. Hamilton JP. Epigenetics: principles and practice. Dig Dis 2011 29:130-5
3. McCabe MT, Brandes JC, Vertino PM. Cancer DNA methylation: molecular mechanisms and clinical implications. Clin Cancer Res. 2009 15(12): 3927-37.
4. Shivapurkar N, Gazdar AF. DNA methylation based biomarkers in non-invasive cancer screening. Curr Mol Med 2010 10(2): 123-32
5. Zhang Y, Jeltsch A. The application of next generation sequencing in DNA methylation analysis. Genes 2010 1: 85-101
6. Jahr S, Hentze H, Englisch S et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001; 61(4): 1659?65.
7. Radpour R, Barekati Z, Kohler C, Lv Q, Burki N, Diesch C, Bitzer J, Zheng H, Schmid S, Zhong XY. Hypermethylation of tumor suppressor genes involved in critical regulatory pathways for developing a blood-based test in breast cancer. PLoS One. 2011 24;6(1):e16080.
8. EGAPP Working Group. Recommendations from the EGAPP working group: can tumor gene expression profiling improve outcomes in patients with breast cancer? Genetics in Medicine 2009 11(1): 66-73

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