원인미상 폐손상 관련 환례군 인체가검물 미생물 검사 결과
Microbiological test results on lung injury with unknown cause

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 호흡기바이러스과            

Ⅰ. 들어가는 말
  2011년 4월부터 주산기 임산부들을 중심으로 발생한 ‘원인미상 중증폐렴’의 감염성 병원체 관련 유무를 파악하기 위하여 질병관리본부 국립보건연구원에서는 해당 의료기관에서 의뢰된 8명의 검체를 대상으로 폐렴 및 폐섬유화와 관련이 있는 것으로 알려진 다양한 세균, 진균 및 바이러스성 병원체에 대한 실험실 진단을 수하였다. 병원체 진단은 환자에게서 채취한 호흡기검체에 존재하는 병원체를 분리하거나   병원체 특이 유전자검출을 통한 직접 진단법으로 확인하고자 하였고, 병원체의 분리 동정 등 직접 진단을 수행하기 어려운 대상 병원체의 경우 환자 혈청내 병원체에 대한 특이항체가의 상승을 확인을 통한   간접적인 혈청진단법을 적용하였다. 병원체 직접 분리 및 유전자 검출을 통한 진단은 감염초기의 급성기에 채취된 검체가 아니면 올바른 결과를 얻기가 어렵다는 제한점이 있고, 본 사례의 경우에는 대부분 초기증상을 보인 후 1개월 이상 경과된 후 검체가 채취되어 질병관리본부로 의뢰된 상황으로 일차적인 원인 병원체를 규명하기 매우 어려운 상황이었다. 그러나 동일시기에 중증 폐렴 소견을 가지는 환자들을 중심으로 유사한 증상의 폐손상 증후군이 계속 보고되어 실제 증상 발현과 직접적인 관련이 있는 병원체를 검출, 또는 특이 병원체에 의해 상승된 항체가를 확인하기 위하여 실험실 진단을 수행하였다. 의뢰된 환자검체를 접종한 세포 배양에서 세포병변효과(cytopathic effect; CPE)를 나타낸 검체에서 아데노  바이러스 및 사람 헤르페스바이러스가 확인되어, 이들의 유전자 변이 유무를 분석함으로써 '원인미상  폐손상'과의 연관성을 파악하였으며, 분리, 확인된 아데노바이러스의 호흡기질환 위해도 평가를 위하여 쥐(mouse) (C57/BL6)를 이용하여 포유동물 호흡기 병원성을 분석 하였다. 

Ⅱ. 몸 말
가. 연구대상, 방법 

1) 연구대상
  조사 초기(2011년 5월) '원인미상 중증폐렴'으로 분류되었던 여성환자 8인으로부터 확보된 검체(전혈 및 호흡기검체)에 대하여 실험실 진단을 수행하였다. 호흡기 검체는 채취된 후 검사시까지 냉장/냉동상태로 보관하면서 일부를 취하여 핵산을 추출하고 병원체에 대한 유전자검사를 수행하였으며, 일부는  바이러스 분리를 위하여 항생제에 처리하였다. 전혈은 실온상태로 24시간 이내에 원심분리를 통해 혈청과 혈구로 분리하여 혈청은 병원체에 대한 항체검사에 사용하였다(Table 1).

2) 혈청학적 진단
  원인미상의 폐질환 검체임을 감안하여 기존의 호흡기질환 관련 바이러스 및 진균에 대한 항체 검사를 우선 수행하였다. 즉, MMR(measles virus, mumps virus, rubella virus), Hantavirus, Seoulvirus,   그리고 Coccidioides immitis에 대한 항체를 확인하기 위해서 혈청학적 진단을 수행하였다. MMR 검사를 위해서 Enzygonost? Anti-Measles-virus, Anti-Mumps-virus, Anti-Rubella-virus(Dade Behring, Germany)시약을 이용하였으며 제조사의 매뉴얼에 따라 EIA검사를 수행하였다. Hantavirus감염여부는 간접면역형광항체법(indirect immunofluorescence assay)를 이용하여 검사하였으며, Coccidioides immitis 감염 여부는 IMMY kit(Immuno-mycologic, USA)를 이용하여 Latex agglutination법과 immunodiffusion법을 통하여 혈청내 특이항체의 존재를 확인하였다.
                             
3) 병원체 분리 및 유전자 검사
  원인병원체 존재 가능성을 규명하기 위해서 환자의 호흡기 검체에서 호흡기바이러스 10종(adenovirus, parainfluenza virus type1-3, respiratory syncytial virus, human coronavirus 229E, OC43, human rhinovirus, human metapneumovirus, human bocavirus), MMR, influenzavirus A/H1N1, A/H3N2, A(H1N1)2009, B, A/H5N1), SARS CoV, enterovirus, varicella zoster virus,   그리고 호흡기세균인 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Group A Streptococci(GAS), Neisseria meningitidis, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, NTM/TB와 비정형폐렴원인병원체인 Mycoplasma pneumoniae와 Chlamydophila pneumoniae에 대한 분리 시도 및 각각의 병원체에 대한 유전자검사를 수행하였다. 유전자 검사는 검체에서 직접 또는 분리를 위한 배양액에서 추출한 핵산을 이용하여 PCR/RT-PCR기반의 방법으로 수행되었다. 인플루엔자  바이러스와 미지의 바이러스 분리를 위해서 검체를 전처리 후 각각 사람세포주인 A549와 Hep-2, 영장류세포주인 Vero, LLC-MK2, Vero/SLAM, 그리고 canine 세포주인 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포주에 접종하였다. 접종 후 7일 동안 세포병변효과를 관찰하였으며, 7일 후 배양  상층액을 수집하여 유전자 검사를 통해 바이러스 분리 여부를 확인하였다.

4) 바이러스 유전자 전장분석
  환자 1예(RPR-1)의 검체에서 분리, 확인된 human adenovirus type 53(HAdV-53)의 전장유전자  분석을 위하여 기존에 이미 보고된 HAdV-53 유전자 염기서열을 주형으로 PrimerSelect program을 이용하여 107개의 primer를 제작하였다. 이후 PCR-walking의 방법으로 RPR-1의 분리주에서  추출한 핵산을 주형으로 PCR을 수행하였으며, 증폭된 PCR 산물 각각을 염기서열분석 및 연계 과정을 통하여 하나의 contig를 구성하는 전장 유전자를 확보하였고 MEGA 4 프로그램을 이용하여 주요 유전자에   대한 상동성 및 계통도 분석을 수행하였다.

5) 포유동물 대상 호흡기 병원성 분석
  세포배양을 통해 RPR-1 환자에서 분리된 HAdV-53의 호흡기 병원성 분석을 수행하기 위해 mouse를 이용한 동물실험을 수행하였다. 양성대조군으로는 사람의 호흡기질환과 연관된 human adenovirus type3(HAdV-3)을 사용하였고, 검체에서 분리된 바이러스를 C57/BL6 mouse에 감염시켜 HAdV-53의 포유동물 호흡기병원성 분석과 50% mouse infectious dose(MID50) 및 접종 후 시간경과에 따른 mouse 장기별 증식 바이러스 역가를 확인하였다.

  나. 연구결과

1) 병원체 실험실 진단 결과
  환자 8인의 혈청을 이용하여 호흡기바이러스(measles, mumps, rubella)와 한타바이러스(Hantavirus, Seoulvirus), Coccidioides immitis에 대한 항체검사를 수행한 결과 모두 음성으로 확인되었다(Table 2).
  호흡기검체에 대해서 호흡기바이러스 10종과 호흡기세균 7종 그리고 비정형폐렴균 2종을 포함한   병원체에 대한 실험실진단 검사 결과 RPR-1에서만 HAdV가 검출되었으며, Hexon 유전자 염기서열분석 결과 type 53으로 확인되었다. 환자 8인의 호흡기검체를 A549세포에 접종한 결과 RPR-1 외에 RPR-2, RPR-5, RPR-8의 검체에서도 세포병변효과를 관찰할 수 있었다(Table 2, Figure 1).
                              
  호흡기검체에 대해서 호흡기바이러스 10종과 호흡기세균 7종 그리고 비정형폐렴균 2종을 포함한   병원체에 대한 실험실진단 검사 결과 RPR-1에서만 HAdV가 검출되었으며, Hexon 유전자 염기서열분석 결과 type 53으로 확인되었다. 환자 8인의 호흡기검체를 A549세포에 접종한 결과 RPR-1 외에 RPR-2, RPR-5, RPR-8의 검체에서도 세포병변효과를 관찰할 수 있었다(Table 2, Figure 1).
  세포병변효과를 유발한 정확한 병원체를 확인하기 위하여 세포배양액에서 핵산을 추출하여 유전자  검사를 수행한 결과 세포병변효과를 보였던 RPR-2, RPR-8의 세포배양액에서 HSV type 1이 검출되었고 RPR-5의 세포배양액에서는 HSV type1과 type2가 동시에 검출되었다(Table 2).

2) HAdV-53 바이러스 역가 측정
  RPR-1에서 분리된 ADV를 HAdV-53/Osong/2011라 명명하였고, plaque assay를 통하여 순수 바이러스를 정제 하였다. 바이러스의 역가는 1.5×105 TCID50/ml로 나타났으며, 기존의 호흡기 관련 아데노바이러스인 HAdV-3과 동일한 조건에서 plaque의 크기를 비교 하였을 때 HAdV-3의 경우 육안으로도 plaque가 확인이 되었으나 HAdV-53의 경우 현미경으로는 plaque가 확인이 되나 육안으로는 확인을 할 수 없을 정도로 plaque의 크기가 작은 경향을 나타내었다(Figure 2). 분리, 정제 후 역가가 확인된 HAdV-53/Osong/2011 바러스는 Micro-neutralization법을 이용하여 동일 환자에서 확보된 혈청내의 anti-HAdV-53/Osong/2011 중화 능력 분석을 확인하였다.
                  
3) HAdV-53 전장분석 결과
  HAdV-53/Osong/2011 분리주의 유전자 전장분석결과 전체 유전자크기는 35.147 kb로 확인되었으며 penton, hexon, fiber유전자는 각각 type 37, type 22, type 8의 유전자와 상동성이 있었다(Figure 3). 전장유전자의 Megablast 결과 가장 최근에 보고된 2004년 Fukui 분리주보다 1996년 Hiroshima 분리주(960528C/Hiroshima/1996)와 가장 높은 상동성(99%)을 보였다(Figure 4).

4) 동물실험결과
  MID50 측정결과 양성대조군으로 사용된 ADV-3의 경우 1.6×102 TCID50, ADV-53의 경우 8.4×101 TCID50이었다. 각 장기별로 바이러스가 분포하는 양상은 두 가지 바이러스 모두 코와 폐 등 호흡기 장기에 주로 분포하고 ADV-3의 경우에 비장에도 일부 분포하는 것으로 확인되었다. 바이러스 감염은 ADV-3의 경우엔 감염 후 21일까지 관찰되었으며, ADV-53의 경우 7일까지 관찰되었고 두   바이러스 모두 감염 이후 더 이상 증폭되지 않고 점차 감소하는 양상을 보였다.  

Ⅲ. 맺는 말

  ‘원인미상 폐손상’의 경우 아직 명확히 질병의 특성 정립이 되지 않았지만 초기에는 임상적 유사성으로 인해 급성간질성폐렴(acute interstitial pneumonia; AIP)으로 보여졌고, 주로 폐의 간질에 병변을 일으키는 특성으로 인해 넓게는 특발성 간질성 폐질환(Idiopathic Interstitial Pneumonias; IIP)에 속할 수 있을 것으로 여겨진다. 지금까지 산발적으로 발생, 보고되었던 특발성 간질성 폐질환의 원인은 명확하지 않고 불명으로 남아있는 예가 많다[1]. 특발성 간질성 폐질환에서의 감염성 미생물에 대한 감염여부가 밝혀져 있는 연구는 전세계적으로도 거의 없으며, 국내 소아의 간질성 폐렴에 대한 몇몇 연구결과에서 human coronavirus 229E형과 parainfluenza virus, 그리고 cytomegalovirus가 검출된 보고가 있으나[2, 3] 해당 병원체가 원인 미상 폐손상의 직접적인 원인으로 작용되었다고 설명하기에는 관련 자료가 매우 부족한 실정이다.
  금번 ‘원인미상 폐손상’의 경우에 있어서도 원인으로서 감염성 병원체의 가능성을 확인하기 위하여  다양한 감염 가능성이 있는 병원체 즉, 호흡기 바이러스 18종, enterovirus, 호흡기세균 7종, mycoplasma 등 비정형 폐렴 병원체 2종, 그리고 Hantavirus, Seoulvirus, 그리고 C. immitis 등에 대한 유전자 및 항체 검사 결과 환자군에서 공통적인 병원체가 확인되지 않았다. 세포배양을 통한 병원체 분리검사한 결과 총 8건 중 1건(RPR-1)의 세포배양액에서 HAdV-53이 확인되었고 바이러스 분리   정제를 통한 plaque 분석 결과 기존의 호흡기 병원체로 알려진 HAdV-3과는 상이한 plaque 형태를  나타내었다. 지금까지 알려진 바에 의하HAdV-53은 유행성각결막염(epidemic keratoconjunctivitis, EKC)의 원인으로 최근 발견되었으며, 같은 유전형(D group)에 포함되어 있는 type 8, type 37, type 22 등 세 가지 다른 형의 유전자가 혼재되어 있는 형태의 바이러스로 알려져 있다[4,7,8]. EKC의 증상이 기술되지 않았던 RPR-1 환자의 호흡기검체에서 분리된 HAdV-53/Osong/2011 또한 유전자 전장분석 결과 type 8, type 37, type 22이 혼재되어있는 재조합 바이러스임이 밝혀졌다. 2004년 일본 등지에서 보고된 HAdV-53과의 유전자 상동성 분석에서도 전장 35 Kb 중 약 99%가 일치하는 등 기존에 알려진 EKC 원인 바이러스인 HAdV-53과 유전적인 유사성이 매우 높은 것으로 나타났다. 그러나 전체적인  유전자 상동성만을 분석하면 기존의 HAdV-53과 매우 유사하기는 하지만 HAdV의 바이러스 독력을  결정하는 것으로 알려진 ORF(open reading frame)가 약 70여 개 이상인 점으로 미루어 볼 때, 이번 ‘원인미상 폐손상’환자에서 분리된 HAdV-53이 호흡기 관련 질환과 연관된 특성을 가지는 가에 대한 추가적인 유전자 분석이 필요하다고 생각된다.
  세포배양을 통하여 추가로 확인된 HSV-1 또는 HSV-2의 경우는 HSV의 감염 특성, 즉 잠재감염되어 있던 HSV가 중환자 치료과정에서 흔히 수반되는 환자의 면역저하 시기에 바이러스의 재활성화(re-activation)에 의한 것으로 보인다[6]. HSV-1의 유전자 일부(gG 및 gE)를 분석한 결과 기존의 HSV-1과 계통학적으로 특이한 점은 없었으며 따라서 HSV-1 및 HSV-2가 호흡기 질환을 유발하였을 개연성은 매우 낮을 것으로 생각된다. 
  HAdV-53의 호흡기 병원성 분석을 위해서 호흡기 아데노바이러스에 감수성이 있다고 알려진 C57/BL6 mouse를 이용한 동물실험을 수행한 결과 감염시킨 HAdV-53/Osong/2011 바이러스와 대조군으로 사용한 HAdV-3 모두 코, 폐 등 호흡기 조직에서 실시간유전자 분석법을 통해 유전자의 존재는 확인되었으나 주요 조직 내에서 육안병변은 명확하게 관찰되지 않았다. 조직별 바이러스 유전자 역가 또한 증가하는 양상을 나타내지 않았다. 하지만 포유동물에 호흡기병원성이 있다고 알려진 HAdV-3  역시 mouse에서 바이러스의 양은 계속 감소하는 경향이었으며, 기존의 연구에서도 mouse에서 adenovirus의 역가 자체는 감소하지만 조직학적인 병변이나 면역학적 분석을 통해서 바이러스의 호흡기병원성을 분석하는 추세이므로 HAdV-53/Osong/2011의 포유동물 병원성을 결론짓기 위해서는 추가적인 분석이 필요하다. 또한 위와 같은 이유로 부분 감수을 가지고 있는 mouse 외에 좀더 감수성이 높은 cotton rat 등의 실험동물을 이용한 추가적인 실험이 이뤄져야 HAdV-53/Osong/2011의 포유동물에서의 호흡기 병원성에 대해 결론지을 수 있을 것이다.
  이상의 결과를 종합하여 볼 때 2011년 4월부터 주산기 임산부들을 중심으로 발생된 ‘원인미상 폐손상’질환에 공통적으로 나타나는 병원체의 분리, 동정, 감염징후는 없었다고 생각되며, 한 환자에게서 분리된 HAdV-53 바이러스 또한 유전자 분석결과 기존에 밝혀진 안과질환 원인병원체와 유전적으로 유사하며 포유동물 실험결과 특이적인 호흡기 병원성이 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 금번 환자들을 대상으로 한 원인 병원체 탐색은 환자가 폐손상 증상을 나타낸 이후 약 1개월 이상 경과된 시점에서 채취된 검체를 대상으로 수행된 관계로 급성 감염성 병원체를 진단하기에는 시차적인 제약이 있을 수 있다. 또한 한 환자에게서만 분리되기는 하였지만 HAdV-53/Osong/2011 바이러스의 유전자 변이분석 방법의 다양화를 통하여 바이러스 독력 결정인자를 추가로 분석하는 연구도 필요하다고 생각된다.
  향후 감염성이 의심되는 원인미상 질환의 병원체를 밝히기 위해서는 면역학적 지표 변화 탐색을 통한 간접적인 접근 방법 개발이 필요하겠고, 관련 학회 및 의료진과의 협력관계를 유지하여 병원체 조기  탐색 체계 구축 및 연구 활성화가 필수적이라 할 수 있을 것이다. 

Ⅳ. 참고문헌

1. Scientific Committee of the Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Disease. 2008 National survey of idiopathic interstitial pneumonia in Korea. Tuberc Respir Dis 2009;66:141-151.
2. Cheon CK, Jin HS, Kan EK, Kim HB, Kim BJ, Yu J, et al. Epidemic acute interstital pneumonia in children occurred during the early 2006. Korean J Pediatr 2008;51:383-390.
3. Kim BJ, Kim HA, Song YH, Yu J, Kim S, Park SJ, et al. Nationwide surveillance of acute interstitial pneumonia in Korea. Korean J Pediatr 2009;52:324-329.
4. Kaneko H, Aoki K, Ishida S, Ohno S, Kitaichi N, Ishiko H, et al. Recombination analysis of intermediate human adenovirus type 53 in Japan by complete genome sequence. J Gen Virol 2011;92:1251-1259.
5. Kajon AE, Gigliotti AP, Harrod KS. Acute inflammatory response and remodeling of airway epithelium after subspecies B1 human adenovirus infection of the mouse lower respiratory tract. J Med Virol 2003;71:233-244.
6. Simoons-Smit AM, Kraan EM, Beishuizen A,Strack van Schijndel RJ, Vandenbroucke-Grauls CM. Herpes simplex virus type 1 and respiratory disease in critically-ill patients: real pathogen or innocent bystander Clin Microbiol Infect 2006;12:1050-1059.
7. Engelmann I, Madisch I, Pommer H, Heim A. An outbreak of epidemic keratoconjunctivitis caused by a new intermediate adenovirus 22/H8 identified by molecular typing. Clin Infect Dis 2006;43:64-66.
8. Aoki K, Kaneki H, Kitaichi N, Ohguchi T, Tagawa Y, Ohno S. Epidemic keratoconjunctivitis due to the novel hexon-chimeric-intermediate 22,37/H8 human adenovirus. J Clin Microbiol 2008;46:3259-3269.