병원체자원 선별을 위한 Rep-PCR법 적용
Automated Rep-PCR analysis for identification of pathogen resources

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 병원체방어연구과            
정경태            

Ⅰ. 들어가는 말
  최근 생명공학기술의 발전 등으로 생명연구자원은 미래의 고부가 가치 창출을 위한 소중한 국가자원으로 중요성이 강조됨에 따라 국가별로 자국의 자원관리에 많은 노력을 기울이고 있다. 국가병원체자원은행에서는 질병의 예방, 진단, 백신 및 신약 개발 등 보건의료연구에 중요한 자원인 인체유래 병원성 미생물을 국가차원에서 확보하기 위해 병원체자원단위은행의 운영 및 기탁사업 등을 통해 매년 수백 건의 병원체를 자원화하고 있으며, 이를 연구자들에게 제공하고 있다. 그러나 지속적인 자원 확보로 인한 병원체자원 증가로 특성이 동일한 자원도 있을 것으로 예상됨에 따라 이들의 중복자원화를 최소화하고 유용한 병원체자원의 선별을 위한 분석방법의 확립이 무엇보다도 필요하다. 
  세균의 strain을 구별하기 위한 방법으로는 유전학적인 특성을 이용한 plasmid analysis, restriction endonuclease analysis, multilocus enzyme electrophoresis(MLEE), multilocus sequence tying(MLST), pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), amplified fragment length polymorphism(AFLP), repetitive sequence-based PCR(rep-PCR) 분석법 등이 있으며 종의 특성에 따라 적용하고 있다. 최근 PFGE, RAPD, AFLP 등은 재현에 문제점을 보였으며, MLST는 재현성은 우수하나 각 특정유전자 염기서열 분석방법으로 분석능력과 종에 제한이 있다는 단점이 있다[1,2]. 이에 반해 rep-PCR법을 이용한 자동화 분석방법은 standardized kit을 제공함에 따라 재현성 면에서 우수하며 무엇보다도 쉽고 빠르게 분석결과를 확인할 수 있다는 장점이 있다.
  이에 본 글에서는 국가병원체자원은행에서 보유 중인 대표자원 등록후보 병원성 Escherichia coli를 대상으로 rep-PCR 자동화 장비를 통한 sub-typing 분석 방법을 소개하고 병원체자원을 선별하기 위한 분석방법의 적용 가능성을 확인하고자 한다. 

Ⅱ. 몸 말
1. Rep-PCR 원리
  원핵세포 유전체 내에는 단백질을 발현하지 못하는 non-coding 지역에 대부분 500bp 이하의 비교적 짧은 단편이 반복적으로 존재하고 있다. 이는 종의 특성에 따라  strain 간에도 반복되는 단편의 횟수에 차이를 보이는데, rep-PCR 분석방법은 이 반복되는 구간을 PCR을 통해 단편들을 증폭함으로써 strain의 subtype을 확인할 수 있는 fingerprinting pattern을 얻을 수 있는 검사법이며[3], DiversiLab SytemTM은 rep-PCR법을 응용한 자동화 장비이다[4].

2. Thermal Cycler Quality Control(TCQC)
  본 실험에 들어가기 전, PCR에 사용할 Thermal Cycler의 QC을 수행하여야 동일 시료에 대한 분석 값(similarity)의 범위를 확인한다. 이 단계는 Thermal Cycler의 각 well에서 PCR 결과가 일정범위 내에서 동일한 결과 값을 확인하고 해당범위에 도달하지 못하는 well들은 본 시험에서 배제하여야 한다. 실험결과 1well을 제외 47well은 similarity 98% 이상의 값을 보여 본 실험에서는 47개의 well들은 사용하여 PCR를 하였으며 동일 strain 구별에 cut-off 값을 similarity 98%로 설정하였다.

3. 분석절차
  1) 핵산추출은 E. coli 국내분리주 177주, 외부도입주 50주를 대상으로 핵산추출키트를 사용하여 핵산을 추출한다. 2) Rep-PCR 증폭 E. coli의 fingerprinting kit를 이용하여 rep-PCR 방법으로 증폭한다. 3) 검출과정은 증폭된 DNA 단편을 Microfluidics DNA Labchip의 channel에 각각 주입하고 Chip는 Bioanalyser를 사용하여 전기영동을 한다. 4) 데이터분석은 DiversiLab 분석 웹사이트(http://kcdcar.diversilab.com)에 접속하여 기존 Database 및 실험 Data간에 비교분석할 수 있다. 전기영동결과는 Virtual gel, Electropherogram의 두 가지 형태로 표현되며, 데이터 분석은 Dendrogram analysis 값 형태로 보여 준다(Figure 1).

4. 분석결과
  자원은행에서 보유하고 있는 E. coli 227주를 대상으로 rep-PCR을 수행하고 결과를 분석한 결과, Similarity 98% 이하를 기준으로 총 88개의 cluster가 확인되었으며[Figure 2(A)] 가장 많은 strain이 속한 그룹은 Group 80으로 35주가 한 cluster를 이루고 있었다. key 값 29번과 88번은 가장 유사도가 낮은 strain으로  49% 값을 보이며, 8개의 이상에서 주요 Pick 값의 차이를 확인할 수가 있었다[Figure 2(B, C)]. 혈청형 O157 29주의 cluster 분포를 확인한 결과  각 cluster에 고르게 분포하고 있었으며 Similarity 범위는 68% 이상임을 확인하였다[Figure 2(D)]. 전체적으로 유사도 범위가 49-98%로 매우 다양한 밴드 패턴들을 보이며 동일 혈청형 내에서도 10개 이상의 다른 type으로 구별됨에 따라 rep-PCR을 이용한 자원 선별이 가능하다고 판단된다.
                 

Ⅲ. 맺는 말

  현재 Strain의 sub-typing의 가장 대표적인 방법의 하나로 PFGE 분석법이 많이 적용되고 있으며, 대장균 Strain typing 분석 또한 golden standard 방법으로 PFGE 방법을 사용하고 있다. 그러나 PFGE 분석법은 실험에 소요되는 시간이 길고(4-5일) 노동집약적이며, 데이터분석이 시험자의 경험에 의해 다양한 견해를 보일 수 있다는 단점이 있어 정확한 결과 값을 얻기 위해 실험절차 및 시료를 표준화하기 위한 많은 노력들이 이루어지고 있다. 이에 rep-PCR 방법을 이용한 DiversiLab systemTM은 최종결과를 얻는데 소요되는 시간이 4시간 이내로 매우 짧으며 자동화된 결과의 분석으로 실험자 간의 오차가 적고 data를 저장 분석하기가 용이하다. 무엇보다도 가장 큰 장점은 높은 재현성을 보여준다는 점이다. 이번 실험결과를 통해 DiversiLab systemTM 을 사용하여 병원성 E. coli의 strain typing의 가능성을 확인하였으며 Group 80에 속하는 35개의 strain들은 rep-PCR 분석결과 Similarity 98% 이상의 결과를 보이는 바, 동일한 혈청형, 독소형을 가지는 strain을 선별하여 은행의 자원관리대상에서 제외하고 후보균주로 관리 전환하고자 하며, Table 1에서 제시된 한 그룹에 2개 이상 존재하는 strain들은 특성정보를 점검하여 자원의 중복성을 검토할 예정이다, 아울러 지속적으로 동일 자원의 선별위한 방법의 도입 및 분석대상자원의 범위를 확대하고자 한다.

Ⅳ. 참고문헌

1. Versalovic, J. et a1. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 6823-6831
2. Wu, F et al. Molecular typing strategies. Semin. Perinatol. 2002; 26: 357-366
3. Koeuth, T. et al. Differential subsequence conservation of interspersed repetitive Streptococcus pneumoniae BOX elements in diverse bacteria. Genome Res. 1995; 5: 408-418
4. Healy M. et al Microbial DNA typing by automated repetitive-sequence-based PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43: 199-207