2010-2011 절기 국내 실험실 감시를 통한 인플루엔자 항바이러스제 내성 양상
Antiviral drugs resistance of influenza viruses isolated in Korea during 2010-2011 season

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스과             
이주연             

Ⅰ. 들어가는 말
  2007-2008 절기 이후 노르웨이를 시작으로 하여 전 세계적으로 오셀타미비르(Oseltamivir, 상품명: 타미플루)에 내성인 계절형 A/H1N1형 바이러스가 크게 유행하였으며, 국내에서도 2008-2009절기에 분리된 A/H1N1형바이러스 내성주가 99% 이상임이 확인된 바 있다[1, 2]. 또한, 조류인플루엔자 및 2009년 4월 이후 인플루엔자 A(H1N1) pdm09 바이러스 대유행과 같은 인플루엔자 유행에 대비하여 타미플루와 같은 항바이러스제 사용이 증가함에 따라 치료제에 내성을 갖는 바이러스 발생이 증가하고 있다(Table 1)[3]. 항바이러스제 내성을 극복하고자 현재 주로 사용되고 있는 오셀타미비르와 같은 NA 억제제 이외의 치료제가 개발 또는 사용 중이다(Table 2). 오셀타미비르 내성주는 주로 neuraminidse(NA) 유전자 275번째 아미노산이 히스티딘에서 타이로신으로 치환된 것으로 인해 발생하나, 2009년 이후 미국, 유럽, 아시아 지역에서 새로운 유전자 변이(NA 유전자 S247N)를 갖는 내성주가 출현한　것과 같이 기존에 알려지지 않은 새로운 변이에 의해 내성주가 발생할 가능성 있다(Figure 1) [4]. S247N과 같은 단독변이로는 타미비르(oseltamivir)나 자나미비르(zanamivir, 상품명: 릴렌자)에 대한 감수성이 일부 감소하지만, H275Y 변이와 중복될 경우 고도 내성을 유발할 수 있는 것으로 보고되고 있다.

                             
  질병관리본부 인플루엔자바이러스과는 인플루엔자 바이러스 국내 분리주를 대상으로 항바이러스제 중 M2 억제제(amantadine)와 NA 억제제(oseltamivir 및 zanamivir)에 대한 내성 감시체계를 연중 운영하고 있다. 이 중 2010-2011 절기 동안 국내 유행 계절 및 2009년형 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제 내성 양상 분석을 통하여 효율적인 인플루엔자 관리 및 임상 과학적 근거자료를 제공하고자 한다. 

Ⅱ. 몸 말
  국내 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제 내성 분석을 위하여 2010-2011 절기(2010.9.1 -2011.8.31) 동안 질병관리본부에서 수행하였던 ‘인플루엔자 및 호흡기바이러스 실험실감시사업’을 통해 확보된 검체 및 바이러스 총 1,976건 중 494건을 선정하였다[A(H1N1)pdm09 355건, A(H3N2) 133건, B 6건](Table 3). 분석 대상은 통계적으로 유의한 자료를 확보하고자 발생 시기별, 지역별, 바이러스 아형을 고려하여 무작위 표본추출법으로 선정하였으며, 치료제로는 M2 억제제(아만타딘)및 NA 억제제(oseltamivir, zanamivir, peramivir)를 대상으로 하였다.

  총 494건 중 계절 및 신종 인플루엔자 A형 바이러스 488주에 대해서는 M2 및 NA 억제제에 대한 내성 양상을 분석하였고, B형 6주에 대해서는 NA 억제제에 대한 내성 양상만 분석하였다. 항바이러스제 내성 분석을 위하여 494건에 대해 유전형 분석(genotypic assay)을 실시하였으며, 이중 S247N 변이가 확인된 바이러스에 대해서는 표현형 분석(phenotypic assay)을 병행하였다.
  M2 억제제에 대한 내성 분석을 위하여 A형 인플루엔자 바이러스 M2 유전자에 대한 염기서열분석을 실시한 후 아만타딘 내성 관련 부위로 알려진 5개 위치(L26F, V27A, A30T, S31N, G34E)를 중심으로 아미노산 변이를 조사하였다. NA 억제제에 대한 내성 발생은 NA 유전자의 염기서열 분석을 통해 내성 관련 아미노산 부위(E119V, R152K, D199N, S247N, H275Y, R293K 및 N295S)를 중심으로 아미노산 변이를 조사하였다. 또한, 2009년 국내 A(H1N1)pdm09 분리주 중 내성관련 변이로 추정되었던 I117M에 대한 변이도 포함하여 분석하였다. 
  NA 억제제에 대한 표현형 분석 시에는 MDCK 세포주를 이용하여 바이러스를 확보하고, 세계보건기구 인플루엔자협력센터인 호주 인플루엔자 표준실험실(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)에서 제공하는 형광뉴라미니데이즈억제법 (Fluorometric Neuraminidase Inhibition Assay, WHO-025)에 의해 NA억제제에 대한 IC50를 조사하였다. 호주 인플루엔자 표준실험실에서 제시한 기준에 따라 IC50 농도가 50-200 nM이면 중등 내성, >200 nM일 경우에는 고도 내성으로 판정하였다.
  M2 억제제에 대한 내성 유전자 분석결과, A형 바이러스 475주[A(H1N1)2009 352주, A/H3N2 123주] 모두 내성으로 나타났다. 아만타딘 내성주 모두에서 M2 유전자 아미노산 31번이 Ser에서 Asn으로 치환되었으며, 나머지 26, 27, 30 및 34번째 위치에서는 아미노산 변이가 나타나지 않았다(Table 3, Figure 2).
                          
  반면, NA 억제제에 대한 내성 양상을 조사한 결과, 총 494건 [A(H1N1)2009 355주, A/H3N2 133주, B 6주] 중 1건(0.2%)이 내성으로 나타났다. 오셀타미비르 내성주는 A(H1N1)2009형 바이러스에서 검출 되었으며, A(H3N2) 및 B형 바이러스에서는 나타나지 않았다. 이는 호주, 영국 등을 비롯한 전 세계 오셀타미비르 내성률(1% 미만) 보다 낮은 수준이며, 이를 통해 국내에서는 아직까지 oseltamivir를 비롯한 NA억제제가 유효함을 추정할 수 있다. 오셀타미비르 내성주는 NA 유전자 아미노산 275번이 His에서 Tyr으로 치환되었으며, 오셀타미비르 내성과 알려진 나머지 위치에서는 아미노산 변이가 나타나지 않았다(Figure 3). 이 내성주에 대한 표현형 분석에서도 IC50 값이 약 439.8 nM로서 오셀타미비르에 내성임이 확인되었으며, 자나미비르(zanamivir)에 대해서는 감수성(IC50 2.1nM)으로 나타났다. 반면, 페라미비르(peramivir)에 대한 IC50은 20.3 nM로서 감수성 대조군과 비교 시 수치가 증가하였으나, 내성은 아닌 것으로 나타. 
                               
  국내에서의 오셀타미비르 내성주는 2008-2009 절기 지역사회 실험실 감시를 통해 계절형 A/H1N1 바이러스에서 99.8% 확인된 바 있으나, 2009년 A(H1N1)pdm09 바이러스 출현 이후 계절 A/H1N1이 유행하지 않아 지역사회 실험실 감시를 통해서는 오셀타미비르에 대한 내성주가 검출되지 않았다. 2009년 이후 분리된 바이러스 중 오셀타미비르 내성주는 A(H1N1)바이러스에서 치료제 투여 후에도 호전되지 않는 중증자 집단에서 확인된 바 있으나, 지역사회 실험실 감시를 통해서는 2010-2011 절기에 처음 확인되었다.
  총 494건의 NA 유전자 분석 대상 중 A(H1N1)pdm09 바이러스에서의 새로운 오셀타미비르 내성 위치로 알려진 NA유전자에서의 247번째 아미노산 변이를 조사한 결과, 국내에서는 2010년 12월부터 2011년 1월까지 전북, 충남 지역의 분리주 8건(1.6%)이 Ser에서 Asp으로의 변이를 갖는 것으로 나타났다. 그러나 이들 분리주에서 NA 유전자 275번째에서의 아미노산 변이는 나타나지 않아 오셀타미비르를 비롯한 NA억제제에 대해서는 여전히 감수성일 것으로 추정되었다. 이를 확인하기 위해 S247N 변이를 갖는 바이러스 2주를 대상으로 NA 억제제(oseltamivir, zanamivir 및 peramivir)에 대한 표현형 분석을 실시한 결과, 2주 모두 오셀타미비르에 대한 IC50 값이 0.2 nM, 자나미비르에 대한 IC50 값이 1.3 nM, 페라미비르에 대한 IC50 값이 0.06 nM 로서 3종류의 약제 모두에 대하여 감수성임을 확인하였다(Figure 4). 따라서 기존 보고에서와 같이 S247N 단독 변이만으로는 내성이 쉽게 유발되지 않음을 확인하였다.
                             

Ⅲ. 맺는 말

  인플루엔자 바이러스가 아만타딘과 같은 M2 억제제에 대하여 높은 내성률을 보이는 반면[5], NA 억제제는 낮은 내성률로 인해 현재 인플루엔자 치료 및 예방에 많이 사용되고 있다. 그러나 오셀타미비르에 대해서도 2008년 이후 계절 A/H1N1형 바이러스에서 높은 내성률(2009년 1월 전 세계 기준 95%)이 보고된 바 있으며[2], 비록 전 세계적으로 1%의 낮은 발생률이긴 하지만 2009년 이후에도 A(H1N1)형 바이러스에서 내성주가 출현하고 있다[3]. 특히, 기존에 알려진 내성 유발 변이 외에도 S247N 변이와 같은 새로운 변이 유전자가 계속 발생할 수 있음을 감안할 때 내성분석 방법의 개선 등을 통한 지속적인 내성 모니터링이 강화될 필요가 있다[4, 6, 7].
  2010-2011 절기 동안 국내 인플루엔자 바이러스 유행주에 대한 내성 양상 조사 결과, A형 바이러스는 아만타딘에 대하여 모두(100%) 내성이었으며, 오셀타미비르에 대해서는 A(H1N1)pdm09 1건만이 내성이었고, A(H3N2) 및 B형 바이러스에 나타나지 않았다. 오셀타미비르 내성주에 대한 표현형 분석결과에서 확인된 바와 같이 오셀타미비르에는 내성이지만 자나미비르와 페라미비르에는 감수성으로 나타나, 오셀타미비르의 낮은 내성률을 감안할 때 현재까지 전 세계적으로 NA억제제가 인플루엔자 치료제로서 적절한 것을 알 수 있다. 향후 내성분석 감시 대상군 확대, NA 억제제 이외의 인플루엔자 바이러스의 다른 유전자 또는 대상을 대상으로 하는 새로운 치료제에 대한 분석법 개발 등 항바이러스제 내성감시체계 강화를 통하여 인플루엔자 관리 및 치료 정책 수립에 필요한 자료를 확보해나갈 예정이다.

Ⅳ. 참고문헌

1. Meijer A, Lackenby A, Hungnes O, Lina B, van der Werf S, et al. Oseltamivir-resistant influenza virus A (H1N1), Europe, 2007-08 season. Emerg Infect Dis 2009;15(4):552-60.
2. WHO. Influenza A(H1N1) virus resistance to oseltamivir-2008/2009 influenza season, nothern hemisphere. 2009.3.18.
3. WHO. Weekly update on oseltamivir resistance to pandemic influenza A (H1N1) 2009 viruses. 2011.5.18.
4. Hurt AC, Lee RT, Keang SK, et al. 2011. Increased detection in Australia and Singapore of a novel influenza A(H1N1)2009 variant with reduced oseltamivir and zanamivir sensitivity due to a S247N neuraminidase mutation. Eurosurveillance 2011;16(23)1-6.
5. Choi W.Y., Kim S.J., Lee N.J., et al., 2009. Amantadine-resistant influenza A viruses isolated in South Korea from 2003 to 2009. Antiviral Res 2009;84:199-202.
6. Sheu TG, Deyde VM, Okomo-Adhiambo M, Garten RJ, Xu X, Bright RA, et al. Surveillance for neuraminidase inhibitor resistance among human influenza A and B viruses circulating worldwide from 2004 to 2008. Antimicrob Agents Chemother 2008;52(9):3284-92.
7. Nguyen HT, Fry AM, Loveless PA, Klimov AI, Gubareva LV.Recovery of a multidrug- resistant strain of pandemic influenza A 2009 (H1N1) virus carrying a dual H275Y/I223R mutation from a child after prolonged treatment with oseltamivir. Clin Infect Dis 2010;51(8):983-4.