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주간건강과질병
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생체분자영상기법을 이용한 고위험병원체 연구
- 작성일2013-08-06
- 최종수정일2013-08-06
- 담당부서감염병감시과
- 연락처043-719-7166
생체분자영상기법을 이용한 고위험병원체 연구
High-risk Pathogen Research using In vivo Molecular Imaging
High-risk Pathogen Research using In vivo Molecular Imaging
국립보건연구원 감염병센터 병원체방어연구과
박필구, 홍기종
Ⅰ. 들어가는 말
생명현상은 생체내에 존재하는 다양한 인자들 간의 복잡한 상호작용들에 의해 이루어진다. 생명과학이 발달함에 따라 수많은 생명현상들이 규명되어 왔지만, 아직까지 우리가 정확히 이해하지 못하는 무수히 많은 기작들이 존재한다. 이제까지의 연구는 개별적인 각각의 기작들에 대한 규명에 초점이 맞추어 진행되어 왔다. 이들 각 개별기작은 전체 생명현상을 이해하기 위한 귀중한 단서를 제공하지만, 많은 경우 전체 생명현상은 각 개별기작들의 단순한 취합만으로 이해되지 못한다. 실제의 생명현상을 이해하기 위해서는 개별 기작들 사이에서 이루어지는 복잡한 상호작용에 대한 규명이 필수적이며, 이는 보다 정확하고 구체적인 시간적, 공간적 정보의 분석이 요구된다. 주로 시험관 내에서 이루어졌던 기존의 연구기법들은 실시간으로 변화하는 생체내 현상에 대한 정보를 제공하기 어려웠지만, 각종 분석기술의 발달을 통해 특정 인자들에 대한 시간별 위치정보에 대한 연속적 실시간 분석이 가능해짐으로써, 생체내에서 발생하는 여러 가지 실제 기작들과 보다 유사한 모델을 이용한 깊이 있는 연구가 진행되고 있으며, 이러한 연구기법 발달의 중심에는 영상분석기술이 있어왔다.
최근 30년간 분자영상기술은 급속도로 발전해 왔다. 고정된 세포에서 특정 인자의 위치를 영상화하는 기술에서부터, 최근에는 살아있는 개체 내에서 특정 인자를 실시간으로 시각화하여 시간별 위치정보를 분석하는, 이른바 생체분자영상 분석까지 가능해졌다. 이러한 생체분자영상기술의 발달은 기존 연구기법이 가진 한계로 인하여 쉽사리 규명되지 못하였던 여러 가지 기작들을 설명할 수 있는 정보를 제공함으로써 현대생물학의 발전에 크게 기여하고 있다. 실제로 생체분자영상을 이용하여 시간에 따른 각종 암의 전이양상에 대한 연구, 줄기세포의 생체내 분열 및 분화기작에 대한 연구 및 면역세포의 추적연구 등이 이루어지고 있다 [1, 2]. 이렇듯 다양한 분야에 걸쳐 생체분자영상 분석기법의 이용이 적극적으로 이루어지고 있으나 고위험병원체 연구 등 감염병 분야에 있어서의 응용은 아직까지 미미한 실정이다. 프랑스 파스퇴르 연구소에서 진행된 발광인자(bioluminescence) 발현 탄저균(Bacillus anthracis)의 감염연구를 비롯하여 야토균(Francisella tularensis), 페스트균(Yersinia pestis) 등에 대한 감염이후 병원체 전파양상의 분석연구가 보고된 바 있으나[3, 4], 타 생물학 분야와 달리 아직 초기단계의 연구만이 진행되고 있으며, 특히 국내에서는 감염기작 및 면역반응에 초점을 맞춘 생체분자영상 분석연구는 거의 전무한 실정이다.
따라서 질병관리본부에서는 발광신호로 표지된 고위험병원체의 생체내 증식양상을 실시간으로 시각화하여 분석할 수 있는 시스템을 구축하고, 이를 실제 고위험병원체 연구에 적용하는 일련의 연구를 수행하였다.
Ⅱ. 몸 말
생체분자영상기술의 핵심은 살아있는 개체 내에서 특정 인자의 위치를 비파괴적으로 영상화하여 추적, 분석할 수 있다는 점에 있다. 비파괴적 실험방법의 장점은 생체내에서의 감염이나 면역반응을 장시간 연속적으로 분석할 수 있다는 것인데, 이와 같이 개체 내에 존재하는 분석대상을 영상화하기 위해서는 해당 인자에 대한 표지화가 필수적이다. 분석대상 인자에 대한 표지화는 주로 형광신호(fluorescence) 및 발광신호(luminescence)를 이용하여 이루어질 수 있지만, 일반적으로 형광신호는 생체가 가지고 있는 배경신호(background signal) 및 생체조직의 투과성, 흡수성 등의 단점을 가지고 있기 때문에, 개체수준의 정밀한 영상화를 위해서는 발광신호를 이용한 표지화가 더 적합한 것으로 알려져 있다[5].
본 연구에서는 발광신호를 이용하여, 고위험병원체인 야토균(Francisella tularensis)을 대상으로 하는 영상분석 시스템을 구축하였으며, 이를 이용하여 야토백신 후보물질에 대한 개체수준에서의 효능검증을 수행하였다.
우선 유전자 재조합 기법을 이용하여 발광인자 표지화를 위한 야토균용 벡터를 제작하였다. 세균 내에서 효소-기질작용에 의해 발광신호를 유도하는 인자들을 발현시키는 박테리아 발광인자 유전자군(Bacterial Lux cassette)을 pKK214 플라스미드 벡터에 삽입하였으며. 야토균에서 활성이 매우 강한 것으로 보고되어 있는 박테리오페리틴(bacterioferritin) 프로모터를 유전자군 앞쪽에 삽입하였다. pKK214 플라스미드는 야토균에서 증식 및 복제가 가능한 플라스미드로 특정 단백질의 야토균 내 발현에 널리 사용되는 벡터이다[6]. 이렇게 제작된 발광인자 표지 플라스미드(pKK214-Lux)를 스웨덴 Umea 대학으로부터 분양받은 약독화 야토균주(Francisella tularensis Live Vaccine Strain)에 도입함으로써, 발광인자를 발현하는 새로운 형질전환 야토균주(Francisella tularensis Live Vaccine Strain)에 도입함으로써, 발광인자를 발현하는 새로운 형질전환 야토균주(F. tularensis LVS-Lux)를 제작하였다.
이후 제작된 F. tularensis LVS-Lux 균주를 실제 동물에 감염시켜 야토균의 증식과 분포 관련 생체분자영상 분석을 위한 동물실험을 수행하였다. 본 연구에서 진행된 모든 동물실험은 국립보건연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 실험기준에 따라 ABSL2 등급 동물실험실에서 수행되었다.
먼저, 5주령 Balb/c 암컷 마우스에 5x102 CFU의 F. tularensis LVS-Lux 균주를 복강에 투여한 후, 매 24시간마다 생체분자영상기기인 Bruker 社의 Extreme 장비로 영상신호를 분석하여 감염 야토균의 생체내 분포양상을 분석하였다. 분석결과, 마우스에 감염된 야토균은 감염이후 복강에서 지속적으로 증식됨이 관찰되었으며, 감염 96시간 이후 간을 비롯한 타 장기로 병원균이 전파됨을 확인할 수 있었다(Figure 1). 감염 후 120시간이 지난 마우스에서 장기를 적출하여 영상신호를 분석한 결과 간, 폐, 비장으로 전파된 발광표지 야토균이 명확히 관찰되었다(Figure 2).
다음으로, 야토백신으로서의 효과가 보고된 바 있는 야토균 유래 LPS의 실제 백신효능을 생체분자영상 분석기법을 이용하여 검증해 보았다. LPS(Lipopolysacc haride)는 그람음성균의 세포표면 구성물질 중 하나로서 일반적으로는 내재면역의 활성화를 유도하는 물질로 알려져 있다. 그러나 기존 연구결과에 따르면, 야토균에서 추출한 LPS는 야토균 특이적인 획득면역의 활성화를 유도함으로써 야토균 감염을 억제하는 효과를 가짐이 보고되어 있다[7]. 본 연구에서는 제 병원체의 체내 증식양상을 시각화함으로써 LPS의 백신점종 효과를 명확히 검증하기 위한 실험을 진행하였다. 5주령 Balb/c 암컷 마우스를 각 그룹당 7마리씩 두 그룹으로 나누어, 실험군에는 야토균에서 추출한 LPS 500 ng을 복강투여하고, 대조군에는 PBS(Phosphate buffered saline)를 투여하였다. 백신처리 6일 이후, 5x104 CFU의 FtLVS-GFP-Lux의 복강투여를 통해 각 그룹의 마우스에 감염시키고 이후 매 24시간마다 각 그룹별 야토균의 체내 분포양상을 비교, 분석하였다. 분석결과, 대조군 마우스에 감염된 야토균은 지속적으로 증식하여 결국 감염 96-120시간 이후 개체의 폐사를 유도한 반면(Figure 3, upper panel), LPS로 백신처리를 한 마우스의 경우에는 100%의 생존율을 보였고, 대조군 마우스에 비해 현저히 낮은 발광신호가 관찰되었으며(Figure 3, lower panel) 이는 감염된 야토균의 체내 증식을 LPS가 효과적으로 억제할 수 있음을 시사한다.
이상의 연구결과를 통해 본 연구에서 구축된 분석기법을 이용하여 고위험병원체의 생체내 감염양상을 실시간으로 추적 및 분석할 수 있는 시스템의 구축이 가능함을 확인하였으며, 야토균에서 추출한 LPS가 효과적인 야토백신으로서 활용될 수 있는 가능성을 개체수준에서 검증하였다.
이상의 연구결과를 통해 본 연구에서 구축된 분석기법을 이용하여 고위험병원체의 생체내 감염양상을 실시간으로 추적 및 분석할 수 있는 시스템의 구축이 가능함을 확인하였으며, 야토균에서 추출한 LPS가 효과적인 야토백신으로서 활용될 수 있는 가능성을 개체수준에서 검증하였다.
Ⅲ. 맺는 말
야토균은 매우 적은 수(〜10 CFU)의 균체에 의해서도 병증을 일으킬 수 있는 고위험 병원체임에도 불구하고, 아직 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 의해 공식적으로 승인된 야토백신은 없는 상황이다. 감염병 예방을 위한 효과적인 백신의 개발을 위해서는 해당 병원체의 감염기작 및 이에 대응하는 면역기전을 제시할 수 있는 기초연구가 필수적이다. 생체분자영상 분석기법을 이용한 감염병 연구는 개체수준에서 감염 병원체의 실시간 위치정보를 제공할 수 있다. 감염이후의 각 시간에 따른 생체내 기관별 영상정보는 보다 구체적이고 자세한 분석을 가능케 함으로써 기존 연구기법으로는 접근에 한계가 있었던 각종 미결과제에 대한 해결책으로 역할을 할 수 있을 것이다.
기존의 일반적인 동물실험기법의 경우 시간별, 위치별로 구체적인 분석결과를 얻기 위해서는 많은 개체의 소모를 필요로 한다. 그러나 본 연구를 통해 확립된 연구기법은 한 개체에서의 반복적인 관찰이 가능하기 때문에 실험에 사용되는 개체의 수를 최소화 할 수 있다. 이는 연구에 소모되는 비용, 노력을 크게 절감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 동물윤리적 측면에서도 매우 바람직한 방법이라 할 수 있다. 또한, 동일 개체에서의 지속적인 분석결과는 실제 연구결과에 큰 영향을 끼칠 수 있는 개체간의 차이 및 그로 인해 발생하는 실험적 오류의 가능성을 배제함으로써, 연구결과의 신뢰도, 정확도를 크게 향상시킬 수 있다.
아울러, 본 연구수행을 통해 확립된 생체분자영상 분석연구는 비단 야토균에만 국한되는 것이 아니다. 특정 병원체 내에서 복제가 가능한 벡터 및 활성화 프로모터의 교체를 통해 여타 고위험병원체에 대해서도 충분히 적용할 수 있다. 생체분자영상 분석을 통한 고위험 병원체의 감염양상 및 이에 대응하는 면역반응에 대한 연구결과는 백신개발을 위한 표적인자의 발굴, 백신 후보물질의 효능 검증 등에 활용될 수 있으며, 백신처리에 의해 감염이 억제되는 장기나 세포 등에 대한 상세한 위치정보, 약물 투여후 치료효과가 나타나는 구체적 시간정보를 제공함으로써 실제 임상 적용 가능성을 타진하기 위한 귀중한 전 임상 자료로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
감염병 연구에 있어 생체분자영상 분석기법의 활용은 커다란 장점과 가능성을 지니고 있다. 생체분자영상 분석을 위해서는 고가의 실험 장비를 비롯한 제반시스템의 구축이 필요하나, 해당 연구를 통해 새로이 얻게 되는 정보는 감염병과 연관된 국민보건상의 난제들을 해결할 수 있는 중요한 자료가 될 수 있기 때문에, 미래지향적인 관점에서 생체영상을 이용한 감염병 연구의 활성화가 필요한 시점이다. 현재 국립보건연구원에서는 이 같은 필요에 주목하여 나노메디신 연구단을 구성하고, 야토균, 유비저균(Burkholderia pseudomallei)을 비롯한 고위험병원체의 생체분자영상 분석연구를 수행하고 있다. 더불어 생체내 병원체 검출의 민감도 개선을 위해 나노분자를 이용한 새로운 진단법 개발연구를 병행함으로써, 향후 발전된 감염병 연구를 위한 기반을 마련할 수 있을 것으로 기대된다.
IV. 참고문헌
1. Edinger M, Cao YA, Verneris MR, Bachmann MH, Contag CH, and Negrin RS. Revealing lymphoma growth and the efficacy of immune cell therapies using in vivo bioluminescence imaging. Blood 2003;101:640-8.
2. Corn DJ, Kim Y, Krebs MD, Mounts T, Molter J, Gerson S, et al. Imaging early stage osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Orthop Res 2013;31:871-9
3. Glomski IJ, Piris-Gimenez A, Huerre M, Mock M, and Goossens PL. Primary involvement of pharynx and peyer’'s patch in inhalational and intestinal anthrax. PLoS Pathog 2007;3:e76.
4. Nham T, Filali S, Danne C, Derbise A, and Carniel E. Imaging of bubonic plague dynamics by in vivo tracking of bioluminescent yersinia pestis. PLoS One 2012;7:e34714.
5. Close DM, Xu T, Sayler GS, and Ripp S. In Vivo Bioluminescent Imaging (BLI): Noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. sensors 2011;11:180-206.
6. Golovliov I, Baranov V, Krocova Z, Kovarova H, and Sjostedt A. An attenuated strain of the facultative intracellular bacterium Francisella tularensis can escape the phagosome of monocytic cells. Infect Immun 2003;71:5940-50
7. Cole LE, Yang Y, Elkins KL, Fernandez ET, Qureshi N, Shlomchik MJ, Herzenberg LA et al. Antigen-specific B-1a antibodies induced by Francisella tularensis LPS provide long-term protection against F. tularensis LVS challenge. PNAS 2009;106:4343-8.
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