보건·의과학 분야에서 투과전자현미경 분석 기술의 최신 동향과 활용

Recent trend and application of transmission electron microscopy in health and medical sciences

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 호흡기바이러스과
최기주

I. 들어가는 말

   렌즈와 현미경의 발명은 인류가 눈으로는 볼 수 없는 미세한 생명의 세계를 탐험할 수 있는 계기를 마련해주었다. 1665년 Robert Hook의 코르크 조직의 관찰을 시작으로 조직, 세포, 박테리아, 바이러스 등 생명체의 생명현상 메커니즘을 규명하기 위해 수많은 연구자의 노력과 재원이 현재까지 투입되고 있다. 1931년 독일의 Max Knoll과 Ernst Ruska는 전자계 렌즈를 이용한 최초의 투과형 전자현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)을 개발하였다. 비록 당시의 전자현미경은 20배 이하의 낮은 확대 배율의 한계를 갖고 있었지만, 미세한 구조 안에서 일어나고 있는 생명체에 대한 경이로움과 호기심을 품은 인류의 끈임 없는 열정은 물리학자와 엔지니어들의 끊임없는 노력으로 마침내 원자들의 배열까지 볼 수 있는 초고전압 투과전자현미경(0.12nm 분해능)과 같은 이미징 분석 장비들을 개발해 내게 되었다. 국립보건연구원 내 설치되어 있는 투과전자현미경과 주사전자현미경은 감염성 세균 및 박테리아의 미세구조변화에 대한 형태학적 연구와 진단을 위해 활용하고 있으며, 유사바이러스입자(Virus like particle; VLP) 기반의 백신 개발을 위한 연구 분야에 지속적인 데이터를 제공하고 있다. 최근 초박절기의 도입으로 세포 및 조직의 미세구조 분석뿐만 아니라 세포 내 특정 단백질의 위치 추적을 위한 면역세포화학염색법과 같은 분석을 제공하고 있다. 
   보건·의과학 분야에서의 이미징 분석은 질병 진단에서부터 치료를 위한 원인규명 연구 분야까지 매우 광범위 하게 활용되어 왔으며, 질병과의 싸움이 계속되는 동안에는 앞으로도 더욱 진보해 갈 것이다. 초기의 이미징 분석은 생명체 원래의 형태를 탐구하고, 내/외부적인 영향에 의한 변화 또는 이상 유무를 분석하고 판정하는 역할을 해왔다면, 현재와 미래는 살아 있는 생명체 내에서 일어나고 있는 모든 생명현상(분자·세포 생물학적, 생화학적)을 가시적으로 확인하고, 추적하고, 더 나아가 예측해 낼 수 있는 역할을 할 것이라고 조심스럽게 기대해 본다.
   이 글에서는 보건·의과학 분야에서 투과전자현미경을 이용한 응용 기술이 현재 어디까지 도달해 있으며, 어떻게 활용되고 있는지에 대하여 살펴보고자 한다.

II. 몸말

   동결전자현미경법(Cryo-transmission electron microscopy; Cryo-TEM) 기술은 냉매를 이용하여 시료를 특정 조건하에 급속 동결시킨 상태에서 투과전자현미경으로 관찰하는 방법으로 살아있는 상태의 형태와 조건을 거의 유사하게 보존시켜 줄 수 있다는 큰 장점이 있다[1]. 이는 기존의 화학적 전처리법에 의해 유발되는 세포 구성 물질의 물리/화학적 변형을 최소화 시켜준다는 점[2]과 면역세포화학법(immunocytochemistry)에서 높은 항체반응 효율(efficiency)을 제공해 준다는 점[3]으로 인해서 최근 주목을 받고 있다. 특수한 장비(고압동결장치 등)에 의해 세포 또는 조직을 극저온(-160℃~-180℃)상태로 급속 동결시키게 되면 세포 내 결정성 얼음(ice crystal)의 형성 없이 수화 상태의 세포 형태를 그대로 보존 시켜줄 수 있게 된다[4]. 이러한 동결고정법을 이용한 분석 형태는 Figure 1에서처럼 몇 가지 방법으로 구분할 수 있다. 
   (A)액체 에탄 급속동결법(Plunge freezing method)은 수용액 상에 존재하는 입자성 물질을 원형 그대로 관찰할 수 있게 해 준다[5]. 적용 가능한 시료는 수 나노미터에서 수백 나노미터 정도 크기의 입자들로 바이러스, 바이러스 유사 입자(Virus like particle), 거대 단백질 복합체, 나노리포좀 등의 분석에 활용할 수 있다. 예를 들면 Figure 2A와 같이 시료를 천공막 그리드(holey grid)에 옮기고 급속도로 액체 에탄(약-170℃)에 낙하시키면 단일층의 동결 시료가 제작된다. 동결상태를 유지하며 TEM상에서 분석하면 Figure 2B와 같은 이미지를 얻을 수 있다. 좀 더 높은 가속전압의 전자현미경(1MV이상)을 이용할 수 있다면 하나의 세포(whole cell: 약 1~5um 두께 부위)까지도 분석이 가능하다. 
   (B)투명화 얼음 절편의 동결전자현미경법(Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Ice Section; CEMOVIS)이라는 분석 기술로 잘 알려져 있으며 과정은 고압동결장치 또는 액체질소 내에서 동결 고정된 시료를 저온유지장치(Freezing chamber)가 장착되어 있는 초박절기(ultramicrotome)로 -120℃∼-160℃ 상에서 약 30~60nm 두께의 절편을 제작하고, Cryo-holder를 사용하여 극저온(-160℃∼-180℃)을 유지한 상태에서 전자현미경으로 분석하는 방법이다[8]. 이 방법은 세포 혹은 조직이 살아 있는 상태(생체 내 수분을 함유하여 구조를 유지하고 있는 상태)와 가장 흡사한 구조를 보여 줄 수 있는 전처리법으로 지질막의 원형 분석, 세포 기질 내 부유 상태의 입자, 막단백질의 구조 분석 등에 활용 될 수 있다.   
   (C)동결절편을 이용한 면역세포화학법(Tokuyasu's method)은 위에 소개했던 ‘(B)’의 동결 절편제작 과정까지는 동일하게 진행하지만 그 목적이 구조분석 보다는 면역염색(Immuno-gold labelling)을 통한 구조체 내에 존재하는 특정 항원의 위치를 추적하기 위함이므로 동결절편 제작 이후부터는 상온에서 면역염색을 거쳐 전자현미경의 분석이 이루어진다. 고정단계에서부터 절편 제작과정까지 높은 항원성을 유지하고 있으므로 전자현미경을 이용한 면역염색 기술 중 가장 좋은 항원-항체 결합의 효율을 제공해 준다. 
   (D)동결치환법(Freeze substitute method)은 동결고정 후 동결상태를 유지하면서 서서히 세포 내의 수분을 치환제 및 포매제로 치환시켜 저온 상에서 중합시킨 후 상온에서 절편을 제작하여 전자현미경으로 분석하는 방법이다[10]. 이러한 동결치환법은 2가지의 장점을 제공해 줄 수 있다. 첫째로, 기존의 화학고정법에 의해 발생되는 형태적 변형을 최소화 하면서 동결절편-관찰법에서 나타나는 단점인 구조체의 낮은 컨트라스트와 1회성 분석(동결절편) 문제를 어느 정도 해결할 만한 좋은 이미지를 제공해 준다. 또한 항원성의 유지로 구조와 항원체 위치 분석의 두 마리 토끼를 잡을 수 있는 방법으로 활용 될 수 있다. 
   전자선 단층사진 분석법(Electron tomography)은 전자현미경을 이용하여 세포 또는 세포 내 미세구조체, 거대 단백질 복합체와 같은 단일 입자(single particle)의 구조를 3차원적으로 재구성해 내는 전자현미경 분석 분야이다. 이는 병원에서 흔히 사용되고 있는 컴퓨터단층촬영기법(CT)과 유사한 개념이지만 세포 내 거대 단백질이나 세포 소기관과 같이 보다 미세한 구조의 입체적인 분석을 가능하게 함으로서 생명현상의 기능을 연구하는 세포생물학 및 구조생물학 분야에 획기적인 전기를 마련하는 기회가 되었다. 전자선 단층사진 분석법을 통해 시료를 3차원적으로 재구성하기 위한 방법은 크게 3가지 방법으로 구분해 볼 수 있다. 
   첫째는 절편제작 과정에서 일반적으로 제작하는 60-80nm 두께보다 두꺼운 0.2-2um 의 절편을 제작하여 약 -70°-70°의 범위에서 시편의 순차적인 각도 변화에 의한 연속 이미지(tilt-series image)를 촬영한 후(Figure 6A,B), 컴퓨터 상에서 연속 이미지들을 정렬(alignment)하여 일정 부피를 갖는 단층 사진을 만들고, 제작된 단층사진을 기반으로 분석하고자 하는 대상 또는 영역을 분할처리(segmentation)하여 소프트웨어 상에서 랜더링을 거치게 되면 분석하고자 하는 대상의 3차원적인 재구성 영상을 얻을 수 있게 된다(Figure 6D-G). 이렇게 제작이 된 데이터 영상은 원하는 각도와 배율상에서 분석할 수가 있어 기본적인 미세구조물의 입체적 형태 분석, 미세구조체간의 상호 연관성 분석, 입체 구조물의 정량적 분석 등이 가능하다.
   두 번째는 시료의 얇은(50~80nm) 연속 절편을 얻어 TEM 상에서 절편의 동일한 부분을 모두 촬영하여 얻은 이미지를 컴퓨터상에서 정렬, 분할처리, 랜더링 과정을 거쳐 3차원 적인 재구성 영상을 얻는 방법이다(Figure 7). 분석하고자 하는 대상에 따라 절편의 두께와 장수를 선택하여 원하는 정도의 범위 내의 데이터를 얻어 낼 수 있지만, 연속절편 제작에서부터 촬영, 이미지 정렬까지는 모두 수작업으로 이루어지기 때문에 많은 시간과 노력이 필요하게 된다. 두 가지 방법을 비교해보면 첫 번째 방법에서 각도 변화에 의한 연속된 이미지는 TEM장비와 구동 소프트웨어에서 자동으로 얻어지기 때문에 두 번째 방법에 비해 시간을 절약할 수 있는 반면, 첫 번째 방법은 재구성하고자 하는 대상의 두께 범위가 한정되어 있는 단점이 있다. 즉 투과전자현미경에서 전자선이 시료를 투과할 수 있는 범위 내에서 절편이 제작되어야 하기 때문에 통상 0.2um에서 2um 정도로 제한될 수 있고, 또한 절편을 약 ±70°로 순차적인 각도 조절에 의해 얻은 이미지를 컴퓨터상에서 다시 역투영(back-projection)하는 방식으로 일정한 두께를 갖는 단층사진(tomogram)이 만들어 지기 때문에 촬영되어지지 못한 사각지대(±20° 범위)에 대한 누락 정보에 의해 정확성이 떨어지는 경우도 발생하기 때문이다.
   마지막 방법은 단일입자(single particle)의 미세한 구조를 3차원적으로 재구성 하는 방법으로 주로 구조 생물학 분야에서 많이 사용된다. 일정한 구조적 패턴을 갖는 거대 단백질의 경우 네거티브염색 또는 급속동결법으로 전처리 후 TEM의 고배율 상에서 단백질 입자들을 촬영하고, 얻어진 이미지를 컴퓨터상에서 선별(picking), 평균화(averaging)하여 좀 더 명확하고, 균일한 형태의 2차원(2D) 이미지를 만들고, 프로그램화된 알고리즘을 이용하여 3차원적인 이미지로 재구성 된다. 이러한 분석 방법은 바이러스 또는 유사바이러스입자(VLP)의 입체적 형태 분석, 세포골격(cytoskeleton)을 구성하는 각종 섬유상 단백질의 구조, 세포 내 기능성 단백질 등의 구조 분석에 활용 되고 있다.
    광학-전자현미경 연동법(Correlative light-electron microscopy; CLEM)은 광학현미경과 전자현미경을 연동하여 동일 절편의 동일 부위를 보다 정밀하게 분석하는 방법으로, 광학현미경 상에서 확인된 대상(target)을 전자현미경상에서 정확하게 분석해 낼 수 있는 장점을 갖고 있다. 최근 의생물학 분야에서 활용도가 매우 높은 형광염색법으로 형광현미경과 공초점현미경이 어느 정도 일반화 되어 있고, 연구에 이용되고 있는데, 광학현미경은 저배율 상에서 세포 혹은 조직 내 특정 단백질의 발현유무 또는 위치를 어렵지 않게 확인할 수 있지만, 이를 전자현미경 상에서 찾아내는 과정은 상황에 따라 많은 시간이 소요 될 수 있다. 예를 들어 세포 내 감염된 바이러스의 위치를 추적하는 과정에서 감염률이 낮아 100개 중 3~5개 정도의 세포에서 바이러스의 위치를 광학현미경상에서 형광염색을 통해 확인할 수 있었다면 이를 전자현미경상에서 찾아내기란 모래밭에서 바늘을 찾아내야 하는 확률을 전제하고 분석해야 한다. 하지만 CLEM 분석법을 사용하면 특정 위치를 파악할 수 있도록 표기(marking)된 그리드 위에 시료를 준비하고, 동결 후 형광현미경상에서 발견된 바이러스의 위치를 지정(mapping)하고, 동일한 그리드를 TEM 상에서 연동된 자동화 위치 분석 시스템(navigation system)으로 정확한 위치를 찾아 분석할 수 있는 효율적인 시스템을 제공한다(Figure 8). 
   액상분석 전자현미경법(Liquid electron microscopy; Liquid-EM)은 장비 구조상 컬럼 내부는 고진공 상태가 유지되어야 한다. 이러한 이유로 인해 전자현미경 분석에 가용되는 시료는 모두 수분이 제거된 상태, 즉 비활성화 또는 죽어있는 상태에서만 가능했다. 여기까지 만으로도 이미 많은 정보들이 우리에게 주어졌지만, 연구자들은 생명현상이 일어나는 원초적인 메커니즘을 보다 근접해서 확인하고 싶어 했고, 이러한 열정과 욕망들이 전자현미경으로 액상의 시료를 분석할 수 있는 기술을 개발해 내게 되었다. 
   액상 분석 전자현미경법(liquid-EM)은 기존의 전자현미경을 그대로 이용하면서 개량된 시료 홀더 혹은 그리드 위의 액상 시료를 포장해 주는 기술이다. 시료홀더 끝부분(전자빔이 투과되는 부분)에 액상의 시료가 주입될 수 있는 통로와 액상의 시료를 관찰할 수 있는 미세공간(cell)을 만들고 상/하로 액상의 분자들이 기화되어 전자현미경의 진공 챔버 내로 유입되는 것을 막기 위한 초미세박막(Si, C)이 샌드위치 형태로 제작되어 있다(Figure 9A, B). 현재는 액상의 무기물이 어떻게 결정을 성장시켜 가는지에 대한 연구들과 살아있는 박테리아의 구조 분석(Figure 9C)과 같은 기초적인 연구들이 진행되고 있지만, 좀 더 기술적인 문제들이 개선된다면 세포 내 기질과 같은 인공의 환경 속에서 어떻게 단백질이 구조체를 형성해가고, 상호 연관성을 나타내는지에 대한 구조적인 연구가 가능해지지 않을까 기대해본다. 
   전자 결정법(Electron crystallography of biological macromolecules)은 X선 회절현상에 기초하여 전자선이 시료에 투과되면서 나타나는 회절 현상을 분석하여 시료를 구성하는 원자의 배열상태와 결정의 구조를 분석하는데 이용된다[17]. 이는 금속등과 같은 결정질에서 뿐만 아니라 생체를 구성하는 단백질 또한 결정성 구조를 갖고 있다는 점을 착안하여 NMR 등의 분석법과 연계하여 생체내 단백질 분자의 구조 분석에 활용할 수 있다. Figure 10에서 보는 것처럼 생체내에서 분리된 단백질을 결정화시키고, 전자현미경 상에서 이미지와 회절패턴을 얻어 컴퓨터 프로그램을 통하여 3차원적인 분자 결합 구조를 재구성해 낼 수 있다.

III. 맺는 말

   보건의료분야에서의 전자현미경을 이용한 분석의 범위는 매우 광범위하기도 하지만 아주 제한적이기도 하다. 장비에 대한 원리와 특성을 이해함으로써 그 제한된 영역을 보다 광범위하게 넓혀 갈 수 있을 것이며, 전자현미경을 좀 더 다양하게 활용하여 지금까지 얻지 못했던 연구 결과들도 얻을 수 있을 것이다.
   최근 수많은 연구자들과 대중들은 생명현상의 일련의 과정들을 가시화된 데이터 상으로 접해오고 있다. 그만큼 이미징 분석 장비들이 많이 개발되었고, 그 기술 또한 날이 더할수록 발전해 가고 있다는 증거이기도 하다. 전자현미경이라는 하나의 이미징 분석 장비를 응용하여 과거와는 비교할 수 없을 만큼 다양한 활용 기술이 접목되고 있고, IT/BT/NT 기술의 발전과 더불어 이미징 분석 분야도 함께 성장해가고 있다. 즉 질병을 정복하고자 하는 인간의 끊임없는 노력과 열정은 복잡한 생명현상에 대한 지속적인 질문들을 만들어 내게 했고, 이러한 지식적 수요와 요구에 반응하여 더욱 진보된 분석 장비들이 지속적으로 개발 되었다고 본다. 
   많은 생명과학자들은 살아있는 세포 속에서 일어나고 있는 역동적인 생명현상을 분자생물학적 단위에서 가시화하여 분석할 수 있는 날을 꿈꾸고 있을 것이다. 이는 과거 SF영화의 장면이 지금 우리의 일상이 되고 있듯이, 전자현미경을 활용한 다양하고 진보된 분석 기술들이 멀지 않은 미래에 가시화된 분자영상들을 우리에게 보여줄 수 있을 것이라고 기대해 본다. 이러한 기대를 앞당기기 위해서는 끊임없는 학문적 필요와 요구를 만들어 내는 동시에 신속하고 정밀한 진단과 연구 기반 형성을 위한 국가차원에서의 지원과 연구 인프라가 좀 더 적극적으로 구축되어야 할 것이다.
   현재 국립보건연구원 내 설치되어 있는 투과전자현미경은 가속전압 120kV의 생물전용 TEM으로 바이러스, 박테리아와 같은 감염성 시료의 진단 및 연구에 활용되고 있고, 생물 세포, 조직 등의 미세구조 분석뿐만 아니라 면역세포화학분석(Immunocytochemistry), 전자선 단층사진 분석(Electron tomography) 시스템을 갖추어 가고 있으며, 향후 Cryo-EM 분석 시스템이 도입 된다면 보건·의과학 분야에서 보다 정밀하고 신속한 이미징 분석 데이터의 제공이 가능하리라 생각된다.

IV. 참고문헌

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