Abstract


Background: Due to continuous emergence of new virus strains, the importance of quick and accurate diagnosis of virus type has been magnified. In order to ensure reliability of test results and to enable sharing of these results between inspecting rooms, HIV standard human antiserum has emerged as a necessity. Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the virus that causes Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). HIV is prevalent in Korea’s neighboring countries such as China, Russia, Southeast Asian countries, etc. The number of HIV-infected persons are steadily increasing in these countries, whose locals directly interact with Koreans. Consequently, the number of local (Korean) AIDS patients is likewise gradually increasing.
Current status: The research on biological standard materials production, based on international standards, has established a production plan for HIV human standard antiserum. Standard materials were produced that incorporated five characteristics (negative, low, medium, high, positive). Each vial of standard material contained about 1 mL and 500 vials were produced. The values of standard materials were measured according to each test plan with optical density using ELISA technique for homogeneity and stability evaluation on standard materials, then the values were recorded in S/C (below 1, 2 - 3, 5 - 6, 15 - 16, over 16). This research analyzed suitability of homogeneity and stability through various statistical methods (Grubbs, Cochran test, one-way analysis of variance, coefficient of variation).In order to assign characteristic value of produced standard material, the uncertainty factor was measured by calculating the standard deviation. Standard materials were produced containing all of the five characteristics. The standard materials were also determined to be homogeneous after evaluating homogeneity. In terms of stability, it was found out that the standard materials were stable for up to six months if they were stored in optimum temperature of -70 ?C. During transportation, the materials were stable for up to seven days if kept in cold storage or freezing condition. Furthermore, the uncertainty factor was evaluated below 8%, and reliability was at 95%.
Prospective future: The produced standard materials should be subject to quality control and equipment calibration. When producing similar biological standard materials, this research process can be utilized as the basis for evaluation.



Ⅰ. 들어가는 말


  신·변종 병원체의 지속적인 출현으로 병원체에 대한 신속하고 정확한 진단의 중요성이 부각되고 있다. 정확한 진단을 위해서는 검사 기관에 대한 인력, 장비, 검사실의 지속적인 관리가 필요하며 특히, 표준화된 진단법과 표준물질이 요구되고 있다.
세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 각종 질병 예방 또는 진단에 사용되는 체외진단용의약품의 개발, 평가, 표준화 및 관리를 위한 국제생물학적 표준물질 (International biological reference standard)의 중요성을 인식하고, 협력기구(Collaborating centre for biological standards and standardization)를 지정하여, 국제 표준물질을 제조·공급하고 있다[1]. 또한, 국제 표준화 기구(International Organization for Standardization, ISO)에서는 세계 각국에서 생산한 특정 표준물질을 세계 모든 국가가 사용할 수 있도록 국제 표준물질 데이터베이스(Code of Reference Material, COMAR)를 운영하고 있다[2].

그러나, 생물학적 표준물질은 물리/화학적 인증표준물질과 달리 요건에서 제시하는 표준물질을 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있는 국제적으로 통용되는 대표적 최상위 시험법이 없고, 측정법 자체가 국제단위계(International system of Units, SI)와 소급성을 유지하기 어려우며, 물질의 단위에 대한 불확도를 직접적으로 표기하기 어렵다[3]. 또한 표준물질의 분류, 생산 프로세스의 표준화 및 생산한 물질에 대한 특성값/인증값 결정 등 다양한 관점에서 기준을 설정하기가 어려운 실정이므로 별도의 전문영역을 구축해야 할 필요성이 대두되고 있다[2].
WHO와 ISO에서는 표준물질에 대한 생산 및 생산한 표준물질의 신뢰성을 확보하기 위하여 국제적으로 통용될 수 있도록 통계기법을 활용한 적합성 평가기준(TRS No. 932 [3], ISO Guide 34 [4])을 제시하고 있으며, 현재는 생물학적 표준물질의 특성을 고려하여 두 요건의 조화를 이룬 표준물질 생산 및 적합성을 평가하도록 권장하고 있다.

후천성면역결핌증(AIDS)은 인간면역결핍바이러스(HIV) 감염에 의해 면역기능이 심하게 손상되면서 다양한 기회 질환들이 출현하는 감염의 마지막 단계를 지칭하는 증후군 이다. HIV는 Retroviridae과, Lentivirus 속으로 분류되는 RNA 바이러스로, HIV에 감염되면 인체의 면역기능 중 세포성 면역에 관계되는 CD4+ T 림프구를 주로 파괴시켜 인체 방어면역력을 떨어뜨린다[5].

HIV 감염자는 인도, 중국, 동남아시아, 러시아 등 우리 나라와 교류가 활발한 주변 국가에서 빠르게 증가함에 따라 국내의 경우에도 2003년, 2013년에 각각 593명, 1,114명으로 10년 사이에 약 2배 증가하고 있어 감염자 관리 및 병원체에 대한 신속 정확한 진단의 중요성이 부각되고 있다[6].
따라서, HIV에 대한 정확한 진단을 위해 국제적인 기준(WHO TRS 932 및 ISO Guide 34)을 적용한 HIV 인간항혈청 표준물질(이하, HIV RM) 생산계획 및 분석 체계를 수립하고자 한다. 또한 수립한 계획대로 표준물질을 제조 및 분석하여 표준물질의 국제적합성을 확보하고자하며, 향후 유사한 생물학적 표준물질의 생산 및 평가에 기초자료로 활용하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말


  생물학적 표준물질을 확보하기 위해서는 표준물질 생산의 품질에 직접 영향을 미치는 프로세스를 파악 및 기획하고 계획된 절차에 따라 표준물질을 생산하여야 한다. 따라서 국제 기준에 따라 HIV 인간항혈청 표준물질(이하, HIV RM) 생산 프로세스 계획을 수립하고, 제조, 측정/시험, 물질의 균질성 평가, 물질의 안정성 평가, 부여된 특성값에 대한 측정 불확도 산출에 대하여 언급하고자 한다.


  HIV RM 생산계획 수립
  생물학적인 표준물질은 인체에서 얻은 검체와 가장 유사한 조건을 갖도록 제작하는 것을 추천하고 있는 바, WHO 협력기구인 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC)에서는 HIV 선별검사에 대한 평가 시 반드시 저농도 표준물질(Low level working standard)을 포함하여 검사할 것을 권장하고 있다[3]. 본 연구에서는 HIV 감염여부 판정을 위해 실시하는 최초의 검사인 선별검사 중 ELISA법으로 특성을 부여하고, HIV 감염자로부터 원료 혈액을 확보하여 저농도를 포함한 5가지 농도로 구성(1set 당 5개 농도, 1ml/vial)하였다(Table 1). 전체적인 생산 계획은 “표준물질 생산 기관의 자격에 대한 일반요건[4]” 및 WHO TRS 932 [3]에 따라 설계, 수립하였다(Figure 1). 

   HIV RM 제조
  HIV RM을 생산하기 위해 임상병원을 통하여 HIV 감염자의 혈장과 협력 혈액원3)으로부터 건강인의 혈장을 확보하였고, 원료물질 적합성 평가[선별검사(Rapid, PA, ELISA법) 및 확인검사(Western blot)]를 통하여 원료물질을 선별하였다. 위탁기관에서는 선별한 원료물질을 이용하여 원료물질을 전처리 및 혈청화하고, 설정한 농도에 적합한 희석배수를 산정하였다. 원료물질을 대량 희석하여 최종적으로 Table 1과 같이 S/C값4)이 1 이하(음성, level 1), 2-3(저농도, level 2), 5-7(중농도, level 3), 15-16(고농도, level 4), 16 이상(양성, level 5)인 HIV RM을 한 종류 당 500 vial 씩 제조하였다[7].

  균질성 평가
  균질성 시험을 위해서는 측정의 추세가 시료제조 당시의 특성으로부터 분리될 수 있도록 무작위로 선정되어야한다. 시험을 위한 개수는 병내 균질성인 경우, 생산한 후보표준물질 중 3 vial을 선정하였고, 병간균질성의 경우 무작위로 선택한 병의 최소 개수는 10과 30 사이이지만 10 이상이 되도록 권장 하므로[8], 생산한 후보표준물질 총 500 vial의 세제곱근에서 3을 곱한 값[9]으로 선정하여 주 실험법인 ELISA법으로 3번 반복 실험하였다[7].

숙련도시험용 시료의 균질성을 확인하는 방법으로 KSA ISO Guide 13528에서 제시하고 있는 방법으로는 일원분산 분석법(ONE-way ANOVA)에 의한 F값과 F기각치를 비교하여 평가하거나[10], 그럽스 검정(Grubbs test)과 코크란 검정(Cochran Q test)을 통해 이상치 유무를 확인하는 방법을 사용하였다. 균질성 시험의 기본 모델은 그룹 간의 일원 분산분석법으로[8] 분석 및 일반적인 통계방법으로는 변동계수 (CV)를 비교하였다.
그 결과, 이상값 판단을 위한 그럽스 검정에서 이상값이 없었으며,5) 등분산성 판단을 위한 코크란 검정 결과 등분 산성으로 판단되어 일원분산분석을 실시하였다. 결과적으로 HIV RM level 1을 제외한 모든 HIV RM level 2-5에서 차이가 있는 것으로 분석되었으나, 변동계수(CV%)로 집단 간 차이를 판단한 결과, 5종류의 HIV RM에서 3% 이내 (0.167-1.206%)로6) 균질성이 확인되었다[2](Table 2).


  안정성 평가
  단기 안정성 연구에서는 2주 동안 3-5개의 시점을 사용하며, 운송조건을 위한 온도당 vial의 수는 6-10개를 취하여 통계적인 타당성을 확보하여야하므로[7] 단기안정성 시점을 1개월간 5개의 시점(0일, 3일, 7일, 14일, 21일)으로 정하였고, 운송조건을 만족하기 위하여 5온도(-70℃, -20℃, 4℃, 실온, 37℃)로 2 vial 씩 주 실험법인 ELISA법으로 3번 반복하였다. 장기안정성 연구에서는 유효기간 설정을 위하여 장기간 보관하고자 하는 적정 온도(-70℃)에서 6개월간 8개의 시점(0일, 3일, 7일, 14일, 21일, 49일, 3개월, 6개월)에, 단기안정성과 동일하게 각 2 vial을 표본 추출하여 주 실험법인 ELISA법으로 3번 반복 실험하였다[7].

시간에 대한 유의성이 있는 추세가 있는 경우, 회귀분석을 통해 회귀계수를 구하고 유의성을 판단하고 만약 추세가 없다면, 일원 배치 분산분석을 통해 집단 간의 변동에 차이가 없음을 확인하거나[8], 균질성평가와 마찬가지로 일반적인 통계방법으로는 변동계수(CV)를 비교하는 방법을 사용하였다.

또한, 소성을 확보하기 위해서 국제적으로 판매하는 표준물질 [HIV1 QC2-Anti-HIV-1 Quality Control Reagent Sample 2 (06/B461, NIBSC, UK), Sample 5 (09/B571, NIBSC, UK)]을 반복 측정하여 제조한 표준물질의 안정성 평가 결과와 비교하였다.
Table 3과 같이 통상적 운송조건(4℃)에서 단기안정성 평가 결과, HIV RM level 1의 경우 49일까지 안정하였고 고온의 운송조건(37℃)에서 3일이 경과하였을 경우 불안정하였다. 또한 모든 HIV RM에서 통상적 운송조건(4℃)에서 49일까지 안정하였고, 고온의 운송조건(37℃)에서 7일까지 안정하였다. 결과적으로 운송조건에서 HIV RM level 1을 제외한 모든 온도에서 7일까지 안정하여, 운송 시 표준물질의 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였다. 단, HIV RM level 1의 경우 37℃에서 안정하지 않으므로 물질 운송 시 냉동 또는 냉장조건으로 포장하여 배송하는 것이 필요하다[2].

보관을 위한 장기안정성 평가 결과, 장기보관하고자 하는 적정 온도인 -70℃에서 회귀분석과 CV%를 확인한 결과 HIV RM level 2, 4, 5는 6개월까지 안정하였다. 그러나 HIV RM level 3의 경우, 회귀분석 결과 49일까지 추세가 없으나 CV%는 6개월까지 결과에서 3% 이내(0.898%)로 확인되어 결과적으로 6개월까지 사용가능하다고 판단하였다(Table 3). 다만 HIV RM level 1의 경우 6개월에서 회귀분석 결과 추세를 보였고 CV%가 3.257%이었지만, 계획 시 설정한 범위에서 벗어나지 않았고 국제표준물질(NIBSC)의 결과를 비교한 바 3.3% 이내7)로 확인되어 6개월까지 사용가능하다고 판단하였다[2].

  측정값 부여
  측정값은 균질성 시험 결과에서 반복측정 결과를 이용하였다. 그 결과, HIV RM level 1에서 0.101, HIV RM level 2에서 2.889, HIV RM level 3에서 6.790, HIV RM level 4에서 15.487, HIV RM level 5에서 31.950이었다[2].

  측정 불확도 평가
  측정 불확도를 평가하는 절차는 모델식 수립, 불확도 요인 파악, 합성표준불확도, 확장불확도, 불확도 보고의 단계로 나눌 수 있다. 균질성 및 안정성 시험에서 얻어진 결과값을 바탕으로 측정 불확도를 평가하였다. 모델식(S/C)을 수립 후, 요인별 표준불확도(균질성, 안정성, 측정값)를 계산하여 이를 합성한 합성표준불확도()를 계산한 뒤, 합성표준불확도를 이용하여 95% 신뢰수준에 포함되는 확장불확도(U)를 산출하였다.
그 결과 table 4와 같이, HIV RM level 1에서 0.008, HIV RM level 2에서 0.027, HIV RM level 3에서 0.061, HIV RM level 4에서 0.270, HIV RM level 5에서 0.358이었으며, 95% 신뢰수준에서 측정값의 범위를 산출하여 신뢰성 척도를 마련하였다.

따라서, 각 표준물질의 특성값을 표현하면 HIV RM level 1은 0.101 ± 0.008, HIV RM level 2는 2.889 ±0.027, HIV RM level 3은 6.790 ± 0.061, HIV RM level 4는 15.487 ± 0.270, HIV RM level 5는 31.950 ± 0.358이었다. 각 결과값에 따른 측정 불확도는 8% 미만(0.903-7.851%)으로 평가되었다[2].

Ⅲ. 맺는 말


  질병을 조기에 진단하기 위해 진단 결과에 대한 신뢰성 확보가 중요하며, 측정 소급성의 확보를 위해 표준화된 진단법과 표준물질[6]이 요구되고 있다. 이 중 생물학적 표준물질은 실험실 정도평가 및 체외진단용 의약품의 개발, 평가와 검사 및 검사방법의 표준화를 위하여 여러 나라에서 개발되어 활용되고 있다.

인간면역결핍바이러스(HIV)는 후천성면역결핌증(AIDS)의 원인 병원체로, HIV 감염인을 조기에 발견하여 치료하면 이차감염을 차단할 수 있을 뿐만 아니라 감염인의 생존율을 증가시킬 수 있다. 또한 HIV 감염으로 인한 경제적 손실을 치료하기 위해 지불되는 진료비 등 ‘직접비용’과 입원으로 인한 활동 제한, 조기 사망 등으로 발생한 소득기회의 상실 분인 생산성 손실 등의 ‘간접비용’을 합하여 생애 전체를 통한 총비용으로 산출하면 HIV 감염인 1인당 약 4억원의 경제적 손실이 발생하는 것으로 추산된 바 있다[12].

인간면역결핍바이러스(HIV)의 감염 여부 검사 결과에 대한 신뢰성을 확보하기 위하여, 국제적 기준에 따라 생물학적 표준물질 특성을 반영한 표준물질 생산계획 및 적합성 평가(균질성 및 안정성 평가, 측정 불확도 산출) 체계를 수립하였다. 적합성 평가체계를 바탕으로 제조한 표준물질에 대한 그럽스 검정, 코크란 검정, 분산분석, 변동계수 순으로 균질성 평가를 수행한 결과 균질하였으며, 회귀분석과 변동계수 순으로 안정성 평가를 수행한 결과 6개월까지 안정한 표준물질을 확보하였다. 또한, 균질성 및 안정성 데이터를 이용하여 측정 불확도를 산출하고 측정값을 부여함으로서 생물학적 표준물질의 신뢰성을 확보하였다.

따라서, 확보된 표준물질은 정도관리용 및 장비 교정용으로도 활용 가능한 것이 확인되었으며, 본 연구 결과는 향후 감염병 진단을 위한 유사 생물학적 표준물질을 생산 시 표준물질의 생산계획 수립 및 표준물질 고유의 값(특성값, 측정 불확도) 부여를 포함한 적합성 평가자료의 기초로 활용 가능할 것이다.

Ⅳ. 참고문헌


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