Abstract


Induced pluripotent stem cell (iPSC) generated from human differentiated cells have proved to be one of the most useful discoveries in regenerative medicine. The iPSCs could serve as replacement of embryonic stem cell (ESC) that possess unique properties of self-renewal and differentiation to various types of cell lineages. The iPSCs also have potentials for personalized medicine for cell therapy without ethical issues and immunological rejections, which ESC treatment has faced in research and clinical trials. The rapid progression in iPSC technology is ongoing and its applications are also expanding to focus on maturation, aging, and metabolism of iPSC-derived differentiated cells to recapitulate the pathological features that have been seen in patients. Here, we review the recent updates in derivation strategies for iPSC production, and current research involving disease modeling, drug screening and cell therapy.


Ⅰ. 들어가는 말


  줄기세포는 스스로 자가 복제가 가능하여 무한한 지속적 공급이 가능하고, 우리 몸의 다양한 세포로 분화가 가능한 자가 증식(Self-renewal)과 분화(Differentiation)의 특성을 가지고 있다. 인체에 다양한 종류의 질병이 각각 발생했을 때, 위와 같은 특성의 줄기세포로부터 분화된 건강한 세포가 이러한 병든 세포를 대체할 수 있기 때문에 줄기세포는 기존의 의학적 질병 치료의 개념을 바꾸게 되는 계기로 최근 재생의학 분야에서 크게 주목 받고 있다. 줄기세포는 크게 분화능에 따라 인체의 모든 조직으로 분화가 가능한 전분화능줄기세포(Pluripotent stem cell)와 심장, 간, 혈액 등의 특정 세포로만의 분화가 가능한 성체줄기세포(Ault stem cell)로 나눌 수 있다.

전분화능줄기세포에는 수정란의 포배기(Blastocyst) 단계의 세포괴(Inner cell mass)를 이용하여 제작하는 배아줄기세포 (Embryonic stem cell)와 체세포의 핵을 난자나 수정란에 삽입 또는 치환하여 제작하는 체세포복제배아줄기세포 (Somatic-cell nuclear transfer), 체세포에 몇몇 유전 인자를 도입하여 제작하는 역분화줄기세포(Induced pluripotent stem cell) 등이 있는데, 이중 배아줄기세포는 현재 모든 전분화능 줄기세포들의 황금표준(Gold standard)으로 간주되어 후성유전학 (Epigenetics) 및 전분화능(Pluripotency) 유지 등을 위한 다양한 특성 규명 연구가 활발히 진행되고 있다. 이미 분화된 세포를 이용하여 전분화능줄기세포로 역분화를 유도하는 방법에 의해 제작되는 줄기세포로는 체세포복제배아줄기세포와 역분화줄기세포가 있는데, 이 두 가지 제작 방법은 모두 인체에서 이미 분화가 완료된 체세포와 유전적으로 일치하는 전분화능줄기세포를 만드는 기술이므로 질병치료를 위한 줄기세포 기반 치료제가 임상 적용되는 환자에게서 나타날 수 있는, 배아줄기세포의 단점 중 하나인 면역거부반응의 부작용을 해결할 수 있는 환자 맞춤형 제작방법이다. 이 두 종류의 줄기세포에 대한 작년 7월자의 사이언스 보고[1]에 의하면, 배아줄기세포를 황금표준으로 간주하여 이와 유전적으로 일치하는(Genetically matched) 체세포복제배아줄기세포와 역분화줄기세포를 각각 비교했을 때, 체세포복제배아줄기세포가 역분화줄기세포보다 후성유전학적으로 배아줄기세포와 보다 유사하여 전분화능의 측면에서 상대적으로 우수하다고 보고하였다.

그러나 이러한 후성유전학적 차이가 특정 세포로의 분화 과정에 얼마나 중요한 의미를 갖을지, 분화가 완료된 세포가 기존 분화세포의 특성에 대한 유사성에 어떤 영향을 줄지에 대해서는 그 답이 아직까지는 불투명하다. 또한 체세포복제배아줄기세포의 제작은 윤리적, 기술적으로 쉽게 접근하기 어려운 치명적 단점이 있다. 따라서 윤리적 문제와 면역거부반응의 부작용 그리고 기술적 접근 측면 등 다양한 시각으로 봤을 때, 재생의학 분야의 활용 범위와 가치가 가장 높을 수 있는 역분화줄기세포는 단순히 배아줄기세포의 대체물로서 뿐만이 아닌 만능 줄기세포를 만드는 핵심기법으로 부상하고 있으며, 차세대 질병치료제로서 그 효율성과 적용범위가 매우 기대되고 있다. 본 기고에서는 역분화줄기세포 제작의 역사적 배경 및 기술 개발의 동향과 임상적용 현황에 대한 정보를 제공함으로써 차세대 질병치료의 활용 전략 수립에 기여하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말

역분화줄기세포 제작의 역사적 배경
  역분화(Reprogramming) 현상은 이미 분화가 완료된 세포가 후성유전학적 변화(Epigenetic alteration)에 의해 초기 미분화 상태로 세포의 특성이 바뀌는 가역적 현상으로서, 2005년 배아줄기세포와 체세포의 융합에 의해 역분화가 유도되는 현상이 사이언스지에 보고됨에 따라[2] 배아줄기세포 내에 역분화 유도 인자들이 존재한다는 것이 알려지게 되었다. 이후 일본 교토대의 Shinya Yamanaka 박사 연구팀은 배아줄기세포의 특성을 유지하는데 관여하는 유전자들을 선별 (Screening)하여 소수 몇몇 유전자만의 도입으로 세포형태 (Morphology)와 자가 증식(Self-renewal)등이 배아줄기세포와 매우 유사한 줄기세포가 생성되는 것을 확인하였다. 2006년 이러한 역분화 인자(Reprogramming factor)들을 이용하여 배아줄기세포와 유사한 특성의 세포로 유도하는 방법에 대해 보고하면서 이렇게 제작된 세포를 최초로 역분화줄기세포 (유도만능줄기세포)라 명명하였으며[3] 이러한 획기적 연구결과의 공로를 인정받아 Shinya Yamanaka 박사는 2012년 영예의 노벨생리의학상의 주인공이 되었다.

인간 역분화줄기세포는 마우스의 역분화줄기세포가 처음 보고된 후 그 이듬해인 2007년, Yamanaka 연구팀과 미국의 Thomson 연구팀에 의해 각각 인간 체세포를 이용하여 역분화줄기세포를 제작할 수 있다는 연구결과가 보고되었다[4, 5]. 이 두 그룹은 일부 동일한 역분화 인자(Reprogramming factor)인 Oct4, Sox2와 각각의 다른 유전인자의 조합으로 역분화줄기세포를 제작함으로써 Oct4와 Sox2가 역분화줄기세포로 유도하는 핵심인자이자, 아직 밝혀지지 않은 역분화 유도 인자(Reprogramming factor)들 또한 존재할 가능성이 있다는 것을 보여주었다. 2007년 인간 역분화줄기세포 제작에 대한 발표 이후, 여러 줄기세포 연구자들에 의해 Oct4와 Sox2 유전자에 UTF1, Wnt3a, Esrrb, E-cadherin 등의 추가적인 유전자 도입으로 역분화줄기세포가 유도될 수 있다는 내용의 연구 결과가 발표되었으며[6-9], Glis1 유전자의 도입에 의해 고효율의 역분화줄기세포 제작방법이 보고되기도 하였다[10]. 또한 초기에는 역분화줄기세포 유도에 피부 섬유아세포(Fibroblast)가 이용되었으나 최근에는 각질형성세포(Keratinocyte), 간세포 (Hepatocyte), 멜라닌세포(Melanocyte), 양막세포(Amniotic cells), 제대혈세포(Cord blood cells), 지방유래줄기세포(Adipose derived stem cells) 등 인체의 거의 모든 종류의 살아있는 세포로부터 역분화줄기세포 제작이 가능하게 되었으며, 환자의 말초혈액이나 소변 샘플 등의 비침습적인 세포 획득방법으로 역분화줄기세포를 제작함으로써 피부 섬유아세포를 이용하는 침습적인 환자샘플 채취의 단점을 해결하였다[11, 12].

역분화줄기세포 제작 기술의 발달
  초기 Yamanaka와 Thomson 박사 연구팀에 의해 고안된 역분화줄기세포 제작방법은 바이러스 시스템을 이용하여 역분화인자가 숙주세포의 유전체에 삽입되면서 안정적인 외래유전자 발현을 유도하여 분화세포를 미분화 상태로 역분화시키는 기술이지만, 대표적인 종양형성유전자로 알려진 c-Myc을 포함하는 역분화인자들이 유전체에 삽입될 때 암이 형성될 수 있는 단점이 있고 그 제작 효율이 매우 낮기 때문에 비삽입성, 비바이러스성 유전자 도입방법이면서 제작 효율은 높이고 종양형성유전자인 c-Myc을 대체할 다른 유전인자나 대체물질들의 처리 등 다양한 역분화줄기세포 제작 기술이 유도되었다.

초기 전형적인 역분화줄기세포 제작 방법인 레트로바이러스나 렌티바이러스를 이용하는 유전자 도입시스템에 c-Myc을 대체할 유전인자인 Glis1등의 유전자 도입[10]이나 Vapolic acid 혹은 CHIR99021등의 대체물질을 처리하는 역분화줄기세포 제작방법이 보고되었으며[13, 14], 높은 제작효율의 비삽입성 바이러스 시스템을 이용하는 센다이바이러스 시스템[15]과 비삽입성·비바이러스 유전자 도입방법인 에피솜[16], 전위유전단위 (Transposone)인 PiggyBAC을 이용하는 방법[17], 합성 modified RNA를 도입하는 방법[18] 등이 보고되었으며, miRNA인 miR-200c, miR-302s, miR-369등을 이용하여 제작하는 방법[19]과 합성화합물(Small chemical compounds)을 이용하는 방법[20]등 다양한 역분화줄기세포 제작 기술이 개발되었다. 이 중 현재 가장 많은 역분화줄기세포 연구자들에 의해 사용되고 있는 센다이바이러스 시스템은 단일음성가닥 RNA(Single-negative stranded RNA) 바이러스를 이용하는 방법으로 숙주세포의 유전체에 삽입되지 않고 세포질 (Cytoplasm)에서 복제(Replication)가 가능한 유전자 도입 시스템으로 고효율의 역분화줄기세포 제작 방법으로 알려져 있으나 이러한 유전자도입 시스템은 바이러스 관련 물질 잔존의 핸디캡이 존재하여 역분화줄기세포 제작 과정과 분화 이후에 남아있을 수 있는 바이러스 서열을 반드시 확인해야 할 필요가 있다[21]. 합성 modified RNA를 이용하는 유전자 도입법 역시 고효율의 역분화줄기세포를 제작할 수 있는 방법으로서 일시적 유전자이입(Transient transfection) 방법이므로 추가적인 외래유전자서열의 잔존을 확인할 필요가 없지만, 제작 과정 중에 사용되는 인터페론 알파 안타고니스트(Antagonist)인 B18R의 지속적인 사용이 요구되어지므로 많은 비용과 제작시간이 소요된다.

위의 언급된 문제점들을 대체하기 위한 방법으로 비삽입성· 비바이러스성 유전자 도입방법이면서 비교적 비용이 저렴한 DNA 기반 에피솜을 이용하는 역분화줄기세포 제작방법이 개발되어있으나 제작 효율이 높지 않아 이를 극복하기 위한 CoMiP(Codon-optimized 4-in-1 minicircle)와 EBNA-1 (Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigene-1)/oriP 유전자도입시스템이 개발되어 제작 효율을 높일 수 있게 되었다[22-24]. 그러나 이 방법은 DNA를 기반으로 하는 유전자 도입 기법이므로 외래유전자 잔존문제에서 역시 자유로울 수 없으므로 일부 남아있을 수 있는 외래유전자 서열의 추가적인 확인 작업이 필요하다[25].

질환 모델링과 신약 발굴
   기존에는 각 질환의 대표 유전자의 과발현 또는 억제 모델을 가진 소동물이나 세포주를 이용하여 신약 발굴 및 독성 연구가 이루어져 동물 모델에 따른 이종 간의 차이 등으로 인한 많은 어려움이 있었으나 최근 역분화줄기세포를 이용한 신약 발굴 또는 독성 연구로 적절하지 않은 불완전한 질환모델 사용 등의 문제점을 보다 경감시킬 수 있게 되었다. 질환의 발병원인은 단순히 소수 특정 유전자의 결함으로만 발병된다고 보기 어렵고 단일 혹은 여러 유전자의 결함 등의 분자적 수준에서부터 세포 간 또는 결함이 있는 조직 간의 상호 작용에 의한 다양한 요소들에 의해 질병 징후가 나타나게 된다. 또한 소아질환을 제외한 대부분의 질병들은 성인이 되어 노화가 진행된 후에 발병되는 경우가 매우 많으므로, 유전적 결함이 있는 세포 간의 상호작용뿐만 아니라 환경적 요소가 질환 발병에 매우 중요한 요인이 될 수 있다. 실제로 환자의 역분화줄기세포를 이용하는 질환모델링은 비교적 소아질환의 경우에 더 유리할 수 있다는 점은 이미 리뷰 논문에 보고된 바 있다[26].

역분화줄기세포 기반 질환 모델링은 환자 샘플로부터 전분화능의 역분화줄기세포를 제작하고 이를 질환 관련 세포로 분화유도를 하여 질병 특이적인 징후를 관찰함으로써 질환의 발병 메커니즘 연구에 이용 하거나 질병치료를 위한 약물 독성 연구, 또는 신약 발굴 등에 활용될 수 있다. 심장질환에서는 최초로 부정맥 심장질환 중 하나인 LQT 증후군(Long QT syndrome) 환자로부터 역분화줄기세포를 수립하였다. KCNQ1 (R190Q) 유전자의 돌연변이(Mutation)와 관련된 질환인 LQT1 환자의 체세포 샘플을 채취하여 환자 역분화줄기세포 유래 분화된 심근세포가 정상대조군과는 다르게 LQT1의 질병 징후가 재현되는 것을 확인하여 역분화줄기세포 기반 심장질환 모델시스템을 제시하였다[27]. 그 후 다양한 LQT의 아류형 (Subtype)인 LQT2, LQT8 질환에서 역분화줄기세포를 이용하는 질환 모델링 연구가 활발히 보고되었으며[28, 29], 복합적 유전적 결함(SCN5A와 KCHNH2 유전자)이 있는 LQT3 환자에서는 실제로 역분화줄기세포를 이용한 질환모델링 연구를 질병치료에까지 적용한 사례도 보고되었다. 독성이 매우 강한 부정맥 심장질환 치료약물인 Flecainide를 LQT3 질환 모델에 그 효과를 미리 확인하여 환자에 치료약물을 투여함으로써 질환 증상이 호전됨이 밝혀졌다[30]. 이것은 역분화줄기세포를 이용한 환자 맞춤형 치료의 대표적인 예라고 볼 수 있다. 또한 최근에는 근위축성 축삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 레오파드 증후군(LEOPARD syndrome), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease)등의 다양한 질병을 대상으로 하는 질환모델링 연구가 활발히 보고되고 있다. 근위축성 축삭경화증의 경우, 이 질환의 대표적인 돌연변이(Mutation) 유전자인 SOD-1의 결함이 있는 환자의 역분화줄기세포에서 분화된 신경세포를 이용하여 다양한 저분자화합물(Small molecule compounds)을 스크리닝(Screening)하여 질병 징후가 호전되는 신물질인 Kenpaullone을 발굴하였다[31].

또한 역분화줄기세포 기반 질환모델 시스템에는 각 질병에 따른 특이적 발병 징후를 재현할 수 있다는 점이 본 시스템의 중요한 장점이라 할 수 있는데, 성인질환의 경우에는 질병 특이 유전자의 결함뿐만이 아니라 성인이 되어 노화과정에서 겪게 되는 다양한 환경적 스트레스(Environmental stress)의 축적에 의해 발병할 수 있기 때문에, 질환 관련 세포로의 분화과정을 최대한 실제 환자의 질환 발병에 영향을 줄 수 있는 환경으로 조성해야 하는 점이 본 질환모델시스템 제작에 매우 중요할 수 있다. 대표적인 실례로 성인질환 중의 하나인 알츠하이머병의 경우, 환자 역분화줄기세포 유래 분화신경세포에 알츠하이머병의 대표적 질병 징후인 아밀로이드 베타(β-amylioid)축적이 확인되어도 질병모델링으로서의 활용에 충분하지 않을 수 있음이 보고되었다[32]. 이는 위에 언급한 바와 같이 질병의 발병은 단순히 한두 가지의 원인에만 국한된 것이 아니고 환자의 나이, 환경 등의 매우 다양한 발병 요소들이 관련될 수 있음을 보여주는 것과 같다. 따라서 환자의 역분화줄기세포에서 분화세포로의 질병 재현을 위한 분화세포 배양기법들에 대해 매우 활발한 연구가 진행되고 있다. 일례로 대표적인 성인질환 중 하나인 파킨슨병의 경우, 노화현상유도를 위해 기존의 신경세포 분화기법에 추가적으로 세포 스트레스 인자인 Progerin을 과발현하여 노화를 유도함으로써 종래에 쉽게 확인할 수 없었던 파킨슨의 발병 징후를 재현해내는 연구가 보고된 바 있으며[33], 인간 신경 줄기세포(Neural stem cell)를 이용하여 3차원적(Three dimensional)으로 알츠하이머병의 발병 징후를 재현해내는 새로운 신경세포 분화 유도를 위한 세포배양기법이 개발되어 기존 배양에서는 확인할 수 없었던 질병 징후들이 관찰되었다[34].

세포치료제의 임상적용
  역분화줄기세포로 만들어진 세포 혹은 조직들을 임상에 이용하는데 있어서는 몇몇의 문제점이 제시되고 있어, 일본과 미국을 제외한 대부분의 국가에서 아직 임상시험 허가를 받지 못한 상황이다. 역분화줄기세포의 메카라고 할 수 있는 일본의 경우 범정부차원에서 역분화줄기세포 기반 재생의료 및 연구 분야를 국가 성장 동력의 하나로 지정하여, 역분화줄기세포 연구 활성화를 위한 ‘4대 연구거점기관(교토대, 이화학연구소(RIKEN), 게이오대, 오사카대)’을 선정하여 역분화줄기세포 분야에 향후 10년간 총 439억 엔(약 4,490억 원)의 예산을 집중 지원하고 있으며, 2013년 7월 최초로 역분화줄기세포를 이용해 안구질환 환자의 망막을 재생하는 임상연구를 승인받아 현재 역분화줄기세포를 이용한 망막색소상피세포의 임상시험에 몰두하고 있다(2014 Nature news). 미국의 경우, 2012년 백악관에서 발표한 ‘National Bioeconomy Blueprint’를 통해 역분화줄기세포 연구를 중점과제로 지정하였으며, 민간 기업인 ACT사에서 배아줄기세포 유래 망막색소상피세포의 임상시험 진행과 함께 역분화줄기세포 유래 인공혈액에 대한 임상시험을 준비하고 있다[35].

역분화줄기세포에서 유래된 세포치료제를 이용하여 실제 임상에 적용하기 위해서는 무엇보다 안전성(Safety)과 유용성(Availability)이 보장되어야 한다. 우선 세포치료제를 위한 역분화줄기세포의 제조 환경은 공인된 GMP(Good Manufacturing Practice) 시설에서 표준화된 제조 및 공정을 위한 운영지침과 시설의 관리 지침의 수행 하에서만 확보될 수 있다. 미국 NIH의 민간위탁 국가줄기세포은행인 WiCell, 영국의 정부기관중심의 UK Stem Cell bank, 일본 교토대의 CiRA 등에서 줄기세포·재생센터의 핵심 이라고 할 수 있는 GMP 수준의 품질을 보장하고 연구협력 활성화에 힘쓰고 있다. 우리나라는 국제 기준에 부합하는 임상 등급의 줄기세포주의 분양·관리 및 표준화를 위한 GMP 시설을 갖춘 국립줄기세포 재생센터가 완공을 눈앞에 두고 있어, 전 세계 임상적용을 위한 유수의 줄기세포 관련 기관들과 어깨를 나란히 할 수 있는 국가 차원의 줄기세포 재생의료 실용화 지원에 박차를 가하고 있다(2016년 완공예정).

그러나 환자에 GMP 등급의 세포치료제를 이용하는 것만으로는 아직 임상적용에 한계가 있다. 환자에게 역분화줄기세포 유래 세포치료제 이식을 한 후에는 인체의 면역계가 이식된 세포 또는 조직을 공격할 수 있으며, 이식된 조직 속에 원하지 않는 미분화 상태의 세포가 일부 남아있거나 역분화줄기세포 제작에 사용된 외래 유전자의 혹시 모를 잔존에 의해 암을 초래할 수도 있다. 이러한 부작용 중, 면역거부 반응은 세포치료제를 위한 역분화줄기세포의 공여자와 세포치료제를 이식 받는 수여자간의 면역계가 최대한 근접할 때 그 부작용이 예방될 수 있다. 배아줄기세포와는 다르게 역분화줄기세포는 세포공여자를 미리 선별하여 제작할 수 있기 때문에 최대한 많은 수의 사람들에게 적용이 가능하도록 현재 전 세계적으로 다른 형태의 HLA (Human Leukocyte Antigen)를 갖고 있는 공여자로부터 역분화줄기세포를 제작, 분양을 하는 줄기세포관련 기관의 국제협력이 활발히 진행되고 있다[36]. 또한 면역거부반응과 미분화세포에 의한 암 형성의 부작용은 단순히 역분화줄기세포에만 국한된 문제점은 아니므로, 배아줄기세포를 이용한 임상시험에서 면역거부나 미분화세포 잔존에 의해 유발될 수 있는 임상 부작용 사례를 꾸준히 모니터링 하고, 역분화줄기세포 제작기법에 의해 발생할 수 있는 부작용을 줄일 수 있는 기술개발의 진보 현황에 대한 지속적인 관련 정보의 축적물이 역분화줄기세포의 임상적용에 충분히 활용되어야 하는 점이 간과 되어서는 안 될 것이다.

Ⅲ. 맺는말


  배아줄기세포의 대체물로서 처음 고안된 역분화줄기세포는 배아줄기세포의 자가증식(Self-renewal)과 전분화능 (Pluripotency)의 특징을 갖고 있으며 배아줄기세포와는 달리 생명윤리적 문제가 없고 면역거부반응에 비교적 자유로우며 개인 맞춤형 세포치료제 및 질환 모델링, 신약개발 분야에서 그 활약이 매우 기대되고 있기 때문에 역분화줄기세포를 이제 더 이상 배아줄기세포의 대체물로서의 활용에만 초점을 맞출 필요가 없게 되었다.

2006년 일본 교토대의 Yamanaka 교수가 처음 역분화줄기세포를 개발한 이래로 전 세계 수많은 관련 줄기세포 석학들에 의해 외래유전자의 도입을 위한 바이러스 시스템 대안 책으로 저분자 화합물이나 단백질 등을 이용한 역분화 기술이 개발되고 있어, 초기 제작기법의 큰 문제점으로 제시되었던 암 유발 가능성의 부작용을 줄일 수 있게 되었으나, 일부 재현성 확보의 문제와 매우 낮은 역분화 효율의 단점이 있으며, 에피솜과 같은 고효율의 비삽입성 비바이러스성 제작 방법일지라도 실제 임상적용에 필수적으로 고려되어야 할 사항인 안전성에 대해서는 여전히 논란이 일고 있다.

실제로 역분화줄기세포의 보다 다양한 활용 영역을 위해서는 우선 제작기법이 좀 더 용이하면서 유전자 조작은 필요 없지만 제작 효율은 우수한 역분화줄기세포의 제작 신기술이 꾸준히 개발되어야 할 것이다. 또한 이와 함께 안전성과 유용성의 확보를 위한 GMP 제조지원 설비구축 및 관련 기관들의 활발한 국제협력이 이루어져야 할 것이다. 향후 역분화줄기세포를 이용하는 질병치료가 미래 혁신시장의 선도 분야로 우뚝 부상하기를 기대해 본다.

Ⅳ. 참고문헌


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