Background
Pathogen resources are considered to be essential materials for vaccine development, diagnostic marker searching, and research of disease mechanisms. Because the Nagoya Protocol has limited the international movement of pathogen resources, it has become difficult to secure pathogen resources in Korea, particularly, viral pathogens. In this task, we secured and deposited domestic viral resources which held clinical and genetic information.
Methodology
This task was approved by the Institutional Review Board; the requirement for informed consent was waved because of the retrospective nature of the task. We cultured previously isolated viruses using conventional or shell vial culture technologies, and collected clinical information about the patients. The cultured viruses were semi-quantified with real-time RT-PCR and were genotyped by sequencing analysis.
Results
Through this task, we were able to collect and secure a total of 66 viral isolates of 7 viruses, to be given to the National Culture Collection for Pathogens. These viral pathogens were expected to be used as raw materials for vaccine development, diagnostic marker searching, and the research of disease mechanisms.


병원체자원은 백신 후보주의 개발, 진단 마커의 탐색, 관련 질병기전 연구 등에 귀중한 자원이 된다[1]. 생물다양성협약(Convention on Biological Diversity)의 부속 협약 중 하나로서, 유전자 자원에 대한 접근과 유전자 자원의 이용에 따른 이익 공유에 관한 나고야의정서(Nagoya Protocol)가 2014년 발효된 후 생물자원으로써 병원체 자원의 가치가 높아졌다[2]. 다른 나라의 병원체자원을 이용하여 진단제, 백신, 치료제 등을 개발할 경우 그 소유권과 이익을 제공한 나라와 공유해야 됨에 따라 세계 각국은 자국의 병원체자원에 대한 주권 확보에 주력하고 있으며 국가 간 병원체자원의 이동 또한 제한되었다.
질병관리본부 국립보건연구원 국가병원체자원은행(National Culture Collection for Pathogens, NCCP)이 발간한 ‘2012년 국가병원체자원은행 연보’에 따르면 국가에서 관리하는 인체유래 병원체자원의 수가 1만주를 넘었다고 한다. 세균과 진균의 경우 국립보건연구원 국가병원체자원은행과 지역거점은행 등을 통해 지속적으로 병원체가 수집 및 자원화되고 있다. 그러나 바이러스의 경우에는 국가병원체자원은행에 14개종 130 주만 자원화되어 있고 지역거점은행도 없는 실정이다[3]. 다만 미래창조과학부와 한국연구재단의 지원을 받아 고려대학교에서 운영하는 병원성 바이러스은행이 17속 102주의 바이러스를 보유하고 있지만 이 중 다수는 국외 표준주이다[4].
이와 같이 바이러스 병원체 자원의 확보는 매우 한정되어 있기 때문에 바이러스가 분리된 환자의 역학 정보 및 바이러스의 유전자 정보가 체계적으로 기록되어 있는 다양한 바이러스 병원체자원의 확보가 시급한 실정이다. 이 단신에서는 2015년 질병관리본부 학술연구개발용역 과제를 통해 임상 분리 바이러스주를 자원화하여 기탁한 결과를 보고하고자 한다.
이 연구는 서울아산병원 임상연구심의위원회의 승인을 얻어 진행하였다(AMC IRB 2015-1125; AMC IRB 2015-1390). 2015년 1월부터 2015년 11월까지 진단을 위해 의뢰된 임상 검체에서 분리한 바이러스를 대상으로 하였다. 분리된 바이러스는 Anyplex RV16 II 다중역전사 중합효소연쇄반응(Seegene, Seoul, Korea) 검사로 동정 결과를 재확인하였다. 동정이 확인된 바이러스는 세포배양 플라스크 T25 (Thermo Scientific Nunc Cell Culture, NY, USA)에서 세포배양을 하거나 ReadyCells을 이용한 shell vial culture (Diagnostic Hybrdids Inc., OH, USA)로 증폭 배양하였다(Table 1).
증폭 배양된 호흡기 바이러스와 enterovirus는 Anyplex RV16 II 다중역전사 중합효소연쇄반응으로 반정량하였으며, 결과는 cycle threshold (Ct) 값으로 나타내었다. Cytomegalovirus (CMV)는 artus CMV LC PCR 키트(Qiagen, CA, USA)로 정량하여 log10 copy/mL로 나타내었다. 기존 문헌에서 사용한 바이러스 표적 유전자를 염기서열 분석하여 유전형을 결정하였다(Table 2). 획득된 바이러스 유전자 염기서열은 MEGA 6.06 version 소프트웨어를 사용하여 ClustalW 프로그램으로 정렬하였으며, Neighbor-Joining 방법으로 계통발생학적 분석을 시행하였다.
환자의 기본 정보와 함께 생체활력징후, 일반혈액검사, 일반화학검사, 혈액응고검사, 기저 질환 등을 수집하였다.
이 과제를 통해 총 66주의 바이러스를 자원화하여 우선 기탁하였다. 바이러스별로는 adenovirus 11주, parainfluenza virus (PIV) 10주(PIV-1 5주, PIV-2 1주, PIV-3 4주), influenza A virus 5주, influenza B virus 5주, enterovirus 11주, respiratory syncytial virus (RSV) 9주(RSV A 3주, RSV B 6주), CMV 11주, rhinovirus 4주였다. 2015년 말과 2016년에 분리된 바이러스는 추가로 자원화하여 기탁할 예정이다.
이 과제의 연구 기간 중 2015년 6-11월까지 enterovirus에 의한 무균성 뇌수막염이 국내에 유행하였다(Figure 1). 특히 2015년 8월과 9월에 뇌척수액에서 enterovirus 양성률이 각각 40.2%, 38.0%에 이르렀다. 해당 기간에 분리되었던 enterovirus 11주의 유전형 검사를 시행한 결과 echovirus 6이 8주(72.7%)로 가장 많았으며, echovirus 11이 2주(18.2%), echovirus 9가 1주(9.1%)였다(Figure 2). 이 연구 과제를 통해 2015년 국내 유행 enterovirus를 분리하여 자원화할 수 있었으며, 유행주의 유전형을 판별할 수 있었다.
CMV glycoprotein B는 숙주 세포에 바이러스가 침입하고, 세포간 전파에 중요한 역할을 하기 때문에 백신 제조에서 주요한 항원이 된다. 따라서 국내 분리 CMV의 gB 유전형 분포를 분석하는 것은 향후 CMV 백신의 제조 또는 국내 적용 시에 주요한 참고 자료가 될 것이다. 이 과제를 통해 국내에서 분리되는 CMV의 gB 유전형이 1-3형(각각 Merlin주, AD169주, Toledo주와 유사)으로 분포하는 것을 알 수 있었다(Figure 3).
Adenovirus, influenza virus, PIV, enterovirus는 배양이 쉽고, 냉동 보관 시 안정성이 높아 자원화가 용이하였다. RSV, CMV의 경우 바이러스 안정성이 떨어져 일부 바이러스주의 경우 계대배양이 어려웠다. RSV는 배양액에 2% fetal bovine serum (FBS)를 첨가하고, CMV는 10% FBS와 7% dimethylsulfoxide (DMSO)를 첨가하여 냉동보관하는 것이 바이러스 생존력을 유지하는데 도움이 된다[14]. 동결건조(lyophilization) 방식은 바이러스 보관을 위해 더 이상 ATCC (American Type Culture Collection)에서 추천하고 있지 않다[14]. 동결건조 시 일부 바이러스는 생존력을 보장할 수 없고, 바이러스에 따라 동결건조 방법이 다양하여 표준화하기가 힘들기 때문이다.
호흡기바이러스는 계절성이 뚜렷하다. 이 과제의 연구 기간이 7개월인 점을 고려할 때 해당 기간 동안 유행하지 않는 바이러스 종이 있을 수 있다. 또한 바이러스는 돌연변이(mutation), 재조합(recombination), 재편성(reassortment) 등을 통해 지속적으로 변화하고, 그 결과 바이러스 다양성, 면역 회피, 숙주 세포 특이성의 변화 등 끊임없이 진화하기 때문에 다양한 임상 분리주의 확보가 필수적이다. 이런 이유로 바이러스 병원체자원의 지속적이고 안정적인 수집을 위해 국가병원체자원 지역거점은행 형태로 지속적으로 바이러스주를 수집할 필요성이 있다.
다양한 바이러스 주를 자원화할 때 바이러스 간 오염을 주의하여야 한다. 따라서 증폭 배양 시 외피를 가지고 있지 않아 상대적으로 외부 환경 생존력이 높은 adenovirus를 가장 나중에 증폭 배양하는 것이 바람직하다.
질병관리본부 병원체자원관리 T/F는 향후 바이러스 병원체자원의 소비자인 연구자들-진단 시약 개발자, 백신 연구자, 치료제 개발자-을 대상으로 바이러스 수요 조사를 진행할 필요가 있다. 수요 조사에 기반을 두어 바이러스별로 우선순위를 정해 바이러스 병원체를 자원화하는 것이 바람직할 것이다.
이 과제를 통해 확보된 바이러스 병원체자원은 향후 해당 바이러스에 대한 진단시약, 백신, 치료제를 개발하고자 하는 연구자들에게 분양될 수 있을 것으로 기대한다.


<참고문헌>

1. 송수진, 이경민, 황규잠. 국가 병원체자원의 수집·관리 및 활용 촉진을 위한 법률 제정의 필요성. 주간 건강과 질병. 2015;8(45):1068-71.
2. Greiber T, Moreno SP, Åhrén M, et al. An explanatory guide to the Nagoya Protocol on access and benefit-sharing. ICUN. 2012.
3. http://www.kdca.go.kr/CDC/contents/CdcKrContentView.jsp?cid=60574&menuIds
4. http://knrrb.knrrc.or.kr/status/possessStatus.jsp
5. Hierholzer JC, Halonen PE, Dahlen PO, et al. Detection of adenovirus in clinical specimens by polymerase chain reaction and liquid-phase hybridization quantitated by time-resolved fluorometry. J Clin Microbiol 1993;31:1886-91.
6. Echevarría JE, Erdman DD, Swierkosz EM, et al. Simultaneous detection and identification of human parainfluenza viruses 1, 2, and 3 from clinical samples by multiplex PCR. J Clin Microbiol 1998;36:1388-91.
7. Durviaux S, Treanor J, Beran J, et al. Genetic and antigenic typing of seasonal influenza virus breakthrough cases from a 2008-2009 vaccine efficacy trial. Clin Vaccine Immunol 2014;21:271-9.
8. Nix WA, Oberste MS, Pallansch MA. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens. J Clin Microbiol 2006;44:2698-704.
9. Sullender WM, Sun L, Anderson LJ. Analysis of respiratory syncytial virus genetic variability with amplified cDNAs. J Clin Microbiol 1993;31:1224-31.
10. Sung H, An D, Lee SO, et al. Detection of a UL97 gene mutation conferring ganciclovir resistance in human cytomegalovirus: prevalence of the D605E polymorphism in Korean immunocompromised patients. Ann Clin Lab Sci 2012;42:429-34.
11. Jeong TD, Sung H, Choi SH, et al. Cytomegalovirus ventriculoencephalitis with compartmentalization of antiviral-resistant cytomegalovirus in a T cell-depleted haploidentical peripheral blood stem cell transplant recipient. Diagn Microbiol Infect Dis 2012;74:307-10.
12. Gonzalez-Sanchez HM, Alvarado-Hernandez DL, Guerra-Palomares S, et al. Cytomegalovirus glycoprotein B genotypes in Mexican children and women. Intervirology 2015;58:115-21.
13. Choi SH, Hong SB, Kim T, et al. Clinical and molecular characterization of rhinoviruses A, B, and C in adult patients with pneumonia. J Clin Virol 2015;63:70-5.
14. ATCC. ATCC Virology Guide - Tips and techniques for propagating virus in tissue culture and embryonated chicken eggs. 2012.


※ 이 글은 2015년 질병관리본부 학술연구개발용역과제인 “바이러스 병원체자원 수집”결과보고서를 일부 요약 정리한 내용입니다.