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국내 분리 cpe-유전자를 갖는 클로스트리듐 퍼프린젠스균의 유전학적 특성 분석
- 작성일2016-08-04
- 최종수정일2016-08-04
- 담당부서수인성질환과
- 연락처043-719-8111
국내 분리 cpe-유전자를 갖는 클로스트리듐 퍼프린젠스균의 유전학적 특성 분석
질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 수인성질환과
정수미, 홍사현, 곽효선*
*교신저자: kwakhyos@korea.kr / 043-719-8111
Abstract
Genetic analysis of cpe-carrying Clostridium perfringens strains isolated in Korea
Division of Enteric Diseases, Centers for Infection Diseases, NIH, CDC
Jung Su-Mi, Hong Sa-Hyun, Kwak Hyo-Sun
Division of Enteric Diseases, Centers for Infection Diseases, NIH, CDC
Jung Su-Mi, Hong Sa-Hyun, Kwak Hyo-Sun
Background: Clostridium perfringens is ubiquitous in the environment and intestinal tracts of most mammals, but this organism can cause gas gangrene and enteritis in humans. Multilocus Sequence Typing (MLST) is a useful and powerful tool for molecular epidemiology. The aim of this study was to determine the molecular epidemiology and virulence gene profile of C. perfringens isolated from food poisoning and sporadic diarrhea cases.
Methodology: C. perfringens isolated from food poisoning and sporadic diarrhea cases were investigated to identify the genetic variations in this organism. MLST was performed on 84 C. perfringens strains obtained from food poisoning isolates (n=34) and sporadic diarrhea isolates (n=50) in Korea. Also, toxin genes (cpa, cpe, cpb, cpb2, etx, and iap) and cpe typing were analyzed by PCR.
Results: MLST analyses of the 84 isolates generated 19 different sequence types (STs); among the 19 STs, 15 were new. MLST gene fragments varied in length from 739 to 554 bps, with average p distances of 0.006 (gyrB gene fragment) to 0.037 (sod gene fragment). ST-41 (36 isolates) were dominant in this study. The food poisoning isolate group and sporadic diarrhea isolate group were distinguished by neighbor-joining tree constructed from STs. Among the PCR-tested toxins, only cpa and cpe toxins were detected.
Methodology: C. perfringens isolated from food poisoning and sporadic diarrhea cases were investigated to identify the genetic variations in this organism. MLST was performed on 84 C. perfringens strains obtained from food poisoning isolates (n=34) and sporadic diarrhea isolates (n=50) in Korea. Also, toxin genes (cpa, cpe, cpb, cpb2, etx, and iap) and cpe typing were analyzed by PCR.
Results: MLST analyses of the 84 isolates generated 19 different sequence types (STs); among the 19 STs, 15 were new. MLST gene fragments varied in length from 739 to 554 bps, with average p distances of 0.006 (gyrB gene fragment) to 0.037 (sod gene fragment). ST-41 (36 isolates) were dominant in this study. The food poisoning isolate group and sporadic diarrhea isolate group were distinguished by neighbor-joining tree constructed from STs. Among the PCR-tested toxins, only cpa and cpe toxins were detected.
Conclusion: These results revealed genetic differences between the food poisoning isolates and sporadic diarrhea isolates.
Keyword: Clostridium perfringens, Multilocus Sequence Typing (MLST)
I. 들어가는 말
클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)는 그람 양성의 간균으로 포자를 형성하며 공기가 없는 혐기적 조건하에서 성장하는 혐기성 균이다[1]. 클로스트리듐 퍼프린젠스는 4가지 주요 독소(alpha, beta, epsilon, iota)의 생산 능력에 따라 5가지(A-E) 유형으로 분류되며 내독소(Enterotoxin, cpe)의 생산은 대부분 A 유형으로 분류되지만 C와 D 유형에서도 나타난다[1]. 내독소(Enterotoxin, cpe)는 식중독과 장 질환을 일으키는 독소로 염색체상(C-cpe)이나 플라스미드상(P-cpe)에서 존재한다[2]. cpe 유전자의 존재위치에 따라 특정한 차이를 보이는데 염색체상에 위치한 cpe 유전자를 갖는 클로스트리듐 퍼프린젠스균은 주로 집단 식중독환자 분리주에서 나타나며, 플라스미드상에 cpe 유전자를 갖는 균주는 산발적인설사환자에서 주로 분리된다. 또한 이들 염색체상에 위치한 cpe 유전자를 갖는 클로스트리듐 퍼프린젠스균은 플라스미드상에 cpe 유전자를 갖는 균주보다 영양세포나 포자가 온도와 pH, 아질산염에 대한 높은 저항성을 갖고, 넓은 범위의 성장온도를 갖는다고 보고되었다[3,4]. 최근 네덜란드 연구팀에서는 MLST 결과를 통해 C-cpe와 P-cpe 유전자를 갖는 클로스트리듐 퍼프린젠스 간의 유전적 계통의 거리가 있음을 확인하여 보고한 바 있다[5].
본 원고에서는 산발적 급성설사질환 환자와 집단식중독 환자로부터 분리된 클로스트리듐 퍼프린젠스를 대상으로 cpe 유전자의 위치 및 MLST 유형을 분석하여 이들 균주와 환자발생양상과의 상관성에 대한 연구 결과를 기술하고자 한다.
II. 몸 말
2014-15년 급성설사질환 실험실 감시사업(EnterNet-Korea)을 통해 송부된 클로스트리듐 퍼프린젠스균 중 cpa, cpe 독소 유전자를 갖는 균주를 선별하였으며 산발적 설사질환 환자로부터 분리된 50균주와 집단식중독 환자로부터 분리된 34균주를 대상으로 연구를 수행하였다. 추가로 4개의 독소유전자(cpb, iap, etx, cpb2)[6,7]를 PCR법으로 수행하였지만 검출되지 않았다.
MLST 분석은 8개의 housekeeping gene(colA, groEL, sod, plc, gyrB, sigK, pgk, nadA)[8]을 PCR법을 이용하여 증폭한 다음 시퀀싱 결과에 따라 유전자 패턴을 분석하였다. 분석된 염기서열은 MLST 웹사이트(http://www.pubmlst.org/cperfringens)에서 Sequence types(ST) number를 확인하였고, 새로운 유형은 “STnew”로 표기하였다. 염기서열 분석은 MEGA6 프로그램을 이용하였다.
MLST 분석결과, sequence types은 19가지 유형이었으며, 그 중 15개가 새로운 유형(STnew-1～15)이었다. 그 다음 MEGA6을 이용하여 8개 alleles의 염기서열을 분석한 결과 각 alleles는 5-9가지 유형을 보였고, 염기서열의 가장 큰 변화를 보인 유전자는 sod 유전자로 32곳(5.8%)에서 염기서열이 달랐으며 (Average p distance가 0.037) 가장 적은 변화를 보인 gyrB 유전자는 염기서열 5곳(0.7%)에서 달랐다(Table 1).
MEGA6에서 Neighbor-joining 방법을 이용하여 sequence type 을 분석한 결과, 두 가지 그룹으로 구분되었다(Figure 1). Group I에 포함된 11개 ST 유형은 ST-41을 제외하고 설사질환 환자로부터 분리된 균주였다. 특히 ST-41은 설사질환 환자와 식중독 환자로부터 분리된 균주가 모두 포함된 유형으로 이 연구에서 가장 높은 분리율(36주, 42.8%)을 보였으며, 10개 지역에서 분리되어 국내에 광범위하게 퍼져있는 것으로 생각하며 국내 클로스트리듐 퍼프린젠스의 식중독 및 설사질환의 대표적인 유전형으로 판단된다(Table 2). Group II에 속한 8개 ST는 집단식중독 환자 분리 주만을 포함하고 있었으며, 전부 서울, 경기에서 분리되었다(Table 2).
cpe 독소 유전자의 위치(염색체상이나 플라스미드상)에 따라 분리 유형과 연관이 있는지 확인하기 위하여 cpe typing을 통하여 분석하였다[9,10]. cpe typing의 방법은 Plasmid cpe locus를 나타내는 IS1151 sequence와 IS1470-like sequence의 primer와 Chromosomal cpe locus의 primer를 이용하여 PCR법을 수행하였다[9].
cpe 독소 유전자가 염색체상에 존재하는 유형은 Group II에 속하는 집단식중독 환자 분리주로 확인되었다. 또한 cpe 유전자가 플라스미드상에 존재하는 유형은 설사질환 환자 분리주에서 cpe typing이 어려웠던 STnew-1과 STnew-13을 제외하고 모든 설사질환 환자 분리주의 ST를 포함하고 있었으며, 집단식중독과 산별적 설사를 일으킨 유형을 다 보이는 ST-41의 경우 cpe 독소 유전자가 플라스미드상에 존재하는 특징을 보였다.
플라스미드에 존재하는 cpe 유전형 분류는 cpe 독소 유전자 하위에 존재하는 IS 종류에 따라 구분되는데, 이 연구에서 조사된 설사질환 분리주 대부분이 cpe 독소 유전자는 IS1151 sequence가 있었고, STnew-15만이 IS1470-like sequence가 있었다.
이 연구결과 산발적 급성설사질환 환자와 집단 식중독 환자로부터 분리된 클로스트리듐 퍼프린젠스 사이에 유전적계통의 차이가 있음을 확인할 수 있었으며 여러 ST 중에 ST-41은 플라스미드상의 cpe 독소 유전자 유형으로 두 가지 분리 유형(산발적인 설사질환과 식중독 발생)에서 공통적으로 분리된 것으로 보아 설사질환과 식중독 발생을 공통적으로 일으킬 수 있는 유형이라고 판단된다. cpe 유전자가 플라스미드상에 존재하는 유형의 감염원 및 감염경로는 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있는 플라스미드의 성질을 고려하여 볼 때 플라스미드상의 cpe 유전자를 보유하고 있는 사람이 조리한 식품을 섭취할 경우 일으킬 수 있다고 생각된다. 또한 cpe 독소 유전자가 염색체상에 존재하는 유형은 다양한 범위에서 오염된 식품, 사람이나 가축의 장내, 토양 등에 널리 존재하기 때문에 환경에서의 오염과 환경 관리에 대한 주의가 필요할 것으로 보인다.
III. 맺는 말
이 연구에서는 cpe 유전자형과 MLST 유형을 비교분석하여 국내에서 분리된 집단식중독 환자와 설사질환 환자에서 분리된 클로스트리듐 퍼프린젠스의 계통발생학적 분포를 분석하여 크게 2가지 유전형이 질환을 일으켰음을 확인하였다. 앞으로 국내 클로스트리듐 퍼프린젠스의 유전적인 특성에 대한 데이터의 축적을 통해 실험실 분자 역학 자료를 시·도 보건환경연구원 및 역학조사팀에 제공하고자하며, 집단 식중독과 설사질환 환자의 정확한 원인규명 도구로써 활용하고자한다.
IV. 참고문헌
1. Miyamoto K, Li J, McClane BA. 2012. Enterotoxigenic Clostridium perfringens: detection and identification. Microbes Environ. 27(4):343-9.
2. Collie RE, McClane BA. 1998. Evidence that the enterotoxin gene can be episomal in Clostridium perfringens isolates associated with non-food-borne human gastrointestinal diseases. J Clin Microbiol. 36(1):30-6.
3. Li J, McClane BA. 2006. Comparative effects of osmotic, sodium nitrite-induced, and pH-induced stress on growth and survival of Clostridium perfringens type A isolates carrying chromosomal or plasmid-borne enterotoxin genes. Appl Environ Microbiol. 72(12):7620-5.
4. Li J, McClane BA. 2006. Further comparison of temperature effects on growth and survival of Clostridium perfringens type A isolates carrying a chromosomal or plasmid-borne enterotoxin gene. Appl Environ Microbiol. 72(7):4561-8.
5. Xiao Y, Wagendorp A, Moezelaar R, Abee T, Wells-Bennik MH. 2012. A wide variety of Clostridium perfringens type A food-borne isolates that carry a chromosomal cpe gene belong to one multilocus sequence typing cluster. Appl Environ Microbiol. 78(19):7060-8.
6. van Asten AJ, van der Wiel CW, Nikolaou G, Houwers DJ, Grone A. 2009. A multiplex PCR for toxin typing of Clostridium perfringens isolates. Vet Microbiol. 136(3-4):411-2.
7. Baums CG, Schotte U, Amtsberg G, Goethe R. 2004. Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates. Vet Microbiol. 100(1-2):11-6.
8. de Jong AEI, Beumer RR, Rombouts FM. 2002. Optimizing sporulation of Clostridium perfringens. J. Food Prot. 65:1457-1462.
9. Miyamoto K, Wen Q, McClane BA. 2004. Multiplex PCR genotyping assay that distinguishes between isolates of Clostridium perfringens type A carrying a chromosomal enterotoxin gene (cpe) locus, a plasmid cpe locus with an IS1470-like sequence, or a plasmid cpe locus with an IS1151 sequence. J Clin Microbiol. 42(4):1552-8.
10. Miyamoto K, Chakrabarti G, Morino Y, McClane BA. 2002. Organization of the plasmid cpe Locus in Clostridium perfringens type A isolates. Infect Immun. 70(8):4261-72.
본 원고에서는 산발적 급성설사질환 환자와 집단식중독 환자로부터 분리된 클로스트리듐 퍼프린젠스를 대상으로 cpe 유전자의 위치 및 MLST 유형을 분석하여 이들 균주와 환자발생양상과의 상관성에 대한 연구 결과를 기술하고자 한다.
II. 몸 말
2014-15년 급성설사질환 실험실 감시사업(EnterNet-Korea)을 통해 송부된 클로스트리듐 퍼프린젠스균 중 cpa, cpe 독소 유전자를 갖는 균주를 선별하였으며 산발적 설사질환 환자로부터 분리된 50균주와 집단식중독 환자로부터 분리된 34균주를 대상으로 연구를 수행하였다. 추가로 4개의 독소유전자(cpb, iap, etx, cpb2)[6,7]를 PCR법으로 수행하였지만 검출되지 않았다.
MLST 분석은 8개의 housekeeping gene(colA, groEL, sod, plc, gyrB, sigK, pgk, nadA)[8]을 PCR법을 이용하여 증폭한 다음 시퀀싱 결과에 따라 유전자 패턴을 분석하였다. 분석된 염기서열은 MLST 웹사이트(http://www.pubmlst.org/cperfringens)에서 Sequence types(ST) number를 확인하였고, 새로운 유형은 “STnew”로 표기하였다. 염기서열 분석은 MEGA6 프로그램을 이용하였다.
MLST 분석결과, sequence types은 19가지 유형이었으며, 그 중 15개가 새로운 유형(STnew-1～15)이었다. 그 다음 MEGA6을 이용하여 8개 alleles의 염기서열을 분석한 결과 각 alleles는 5-9가지 유형을 보였고, 염기서열의 가장 큰 변화를 보인 유전자는 sod 유전자로 32곳(5.8%)에서 염기서열이 달랐으며 (Average p distance가 0.037) 가장 적은 변화를 보인 gyrB 유전자는 염기서열 5곳(0.7%)에서 달랐다(Table 1).
MEGA6에서 Neighbor-joining 방법을 이용하여 sequence type 을 분석한 결과, 두 가지 그룹으로 구분되었다(Figure 1). Group I에 포함된 11개 ST 유형은 ST-41을 제외하고 설사질환 환자로부터 분리된 균주였다. 특히 ST-41은 설사질환 환자와 식중독 환자로부터 분리된 균주가 모두 포함된 유형으로 이 연구에서 가장 높은 분리율(36주, 42.8%)을 보였으며, 10개 지역에서 분리되어 국내에 광범위하게 퍼져있는 것으로 생각하며 국내 클로스트리듐 퍼프린젠스의 식중독 및 설사질환의 대표적인 유전형으로 판단된다(Table 2). Group II에 속한 8개 ST는 집단식중독 환자 분리 주만을 포함하고 있었으며, 전부 서울, 경기에서 분리되었다(Table 2).
cpe 독소 유전자의 위치(염색체상이나 플라스미드상)에 따라 분리 유형과 연관이 있는지 확인하기 위하여 cpe typing을 통하여 분석하였다[9,10]. cpe typing의 방법은 Plasmid cpe locus를 나타내는 IS1151 sequence와 IS1470-like sequence의 primer와 Chromosomal cpe locus의 primer를 이용하여 PCR법을 수행하였다[9].
cpe 독소 유전자가 염색체상에 존재하는 유형은 Group II에 속하는 집단식중독 환자 분리주로 확인되었다. 또한 cpe 유전자가 플라스미드상에 존재하는 유형은 설사질환 환자 분리주에서 cpe typing이 어려웠던 STnew-1과 STnew-13을 제외하고 모든 설사질환 환자 분리주의 ST를 포함하고 있었으며, 집단식중독과 산별적 설사를 일으킨 유형을 다 보이는 ST-41의 경우 cpe 독소 유전자가 플라스미드상에 존재하는 특징을 보였다.
플라스미드에 존재하는 cpe 유전형 분류는 cpe 독소 유전자 하위에 존재하는 IS 종류에 따라 구분되는데, 이 연구에서 조사된 설사질환 분리주 대부분이 cpe 독소 유전자는 IS1151 sequence가 있었고, STnew-15만이 IS1470-like sequence가 있었다.
이 연구결과 산발적 급성설사질환 환자와 집단 식중독 환자로부터 분리된 클로스트리듐 퍼프린젠스 사이에 유전적계통의 차이가 있음을 확인할 수 있었으며 여러 ST 중에 ST-41은 플라스미드상의 cpe 독소 유전자 유형으로 두 가지 분리 유형(산발적인 설사질환과 식중독 발생)에서 공통적으로 분리된 것으로 보아 설사질환과 식중독 발생을 공통적으로 일으킬 수 있는 유형이라고 판단된다. cpe 유전자가 플라스미드상에 존재하는 유형의 감염원 및 감염경로는 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있는 플라스미드의 성질을 고려하여 볼 때 플라스미드상의 cpe 유전자를 보유하고 있는 사람이 조리한 식품을 섭취할 경우 일으킬 수 있다고 생각된다. 또한 cpe 독소 유전자가 염색체상에 존재하는 유형은 다양한 범위에서 오염된 식품, 사람이나 가축의 장내, 토양 등에 널리 존재하기 때문에 환경에서의 오염과 환경 관리에 대한 주의가 필요할 것으로 보인다.
III. 맺는 말
이 연구에서는 cpe 유전자형과 MLST 유형을 비교분석하여 국내에서 분리된 집단식중독 환자와 설사질환 환자에서 분리된 클로스트리듐 퍼프린젠스의 계통발생학적 분포를 분석하여 크게 2가지 유전형이 질환을 일으켰음을 확인하였다. 앞으로 국내 클로스트리듐 퍼프린젠스의 유전적인 특성에 대한 데이터의 축적을 통해 실험실 분자 역학 자료를 시·도 보건환경연구원 및 역학조사팀에 제공하고자하며, 집단 식중독과 설사질환 환자의 정확한 원인규명 도구로써 활용하고자한다.
IV. 참고문헌
1. Miyamoto K, Li J, McClane BA. 2012. Enterotoxigenic Clostridium perfringens: detection and identification. Microbes Environ. 27(4):343-9.
2. Collie RE, McClane BA. 1998. Evidence that the enterotoxin gene can be episomal in Clostridium perfringens isolates associated with non-food-borne human gastrointestinal diseases. J Clin Microbiol. 36(1):30-6.
3. Li J, McClane BA. 2006. Comparative effects of osmotic, sodium nitrite-induced, and pH-induced stress on growth and survival of Clostridium perfringens type A isolates carrying chromosomal or plasmid-borne enterotoxin genes. Appl Environ Microbiol. 72(12):7620-5.
4. Li J, McClane BA. 2006. Further comparison of temperature effects on growth and survival of Clostridium perfringens type A isolates carrying a chromosomal or plasmid-borne enterotoxin gene. Appl Environ Microbiol. 72(7):4561-8.
5. Xiao Y, Wagendorp A, Moezelaar R, Abee T, Wells-Bennik MH. 2012. A wide variety of Clostridium perfringens type A food-borne isolates that carry a chromosomal cpe gene belong to one multilocus sequence typing cluster. Appl Environ Microbiol. 78(19):7060-8.
6. van Asten AJ, van der Wiel CW, Nikolaou G, Houwers DJ, Grone A. 2009. A multiplex PCR for toxin typing of Clostridium perfringens isolates. Vet Microbiol. 136(3-4):411-2.
7. Baums CG, Schotte U, Amtsberg G, Goethe R. 2004. Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates. Vet Microbiol. 100(1-2):11-6.
8. de Jong AEI, Beumer RR, Rombouts FM. 2002. Optimizing sporulation of Clostridium perfringens. J. Food Prot. 65:1457-1462.
9. Miyamoto K, Wen Q, McClane BA. 2004. Multiplex PCR genotyping assay that distinguishes between isolates of Clostridium perfringens type A carrying a chromosomal enterotoxin gene (cpe) locus, a plasmid cpe locus with an IS1470-like sequence, or a plasmid cpe locus with an IS1151 sequence. J Clin Microbiol. 42(4):1552-8.
10. Miyamoto K, Chakrabarti G, Morino Y, McClane BA. 2002. Organization of the plasmid cpe Locus in Clostridium perfringens type A isolates. Infect Immun. 70(8):4261-72.
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