Abstract
BACKGROUND: Vancomycin is being used for treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), but vancomycin-intermediate S. aureus (VISA) emerged and was reported in Japan in 1996. Since then, VISA and vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) have become growing concerns worldwide. In the present study, we investigated the characteristics of VISA isolated in Korea in 2015.
METHODOLOGY: Confirmatory tests for vancomycin resistance were performed on S. aureus isolates procured from tertiary hospitals that participated in the Sentinel Surveillance System for VRSA and VISA in 2015. VISA isolates were confirmed by vancomycin MIC values of agar dilution, broth microdilution and Etest according to the CLSI guideline (M100-S24, 2015). Molecular characterization was performed using MLST, SCCmec, agr, rep-PCR typing, and toxin genes, including, toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) and enterotoxins.
RESULTS: Thirty-five out of 53 referred isolates were identified as VISA isolates with vancomycin MIC of 3 mg/L or more. The isolates were characterized as follows: ST5-SCCmec II-agr II with enterotoxin genes of sec-seg-sei (31 isolates), sea-sec-seg-sei (3 isolates), and negative (1 isolate), respectively. TSST-1 gene was detected in all VISA isolates. Rep-PCR typing showed that 34 VISA strains belong to the same cluster (>95% homology).
CONCLUSION: In 2015, 35 VISA strains were isolated in Korea, but VRSA was not detected. All VISA isolates showed ST5-SCCmec II-agr II type patterns.

Ⅰ. 들어가는 말

황색포도알균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 피부염, 균혈증, 폐렴, 식중독 등 다양한 감염증을 일으키는 병원체로서 의료관련감염의 주요 원인균으로 보고되고 있다[1]. 1940년도에 페니실린(Penicillin)이 임상에 처음 도입되어 황색포도알균 감염 치료에 사용되었으나 1950년대에 페니실린 내성 황색포도알균이 60% 이상으로 증가했다. 이를 치료하기 위하여 개발된 메티실린(Methicillin)이 1960년에 도입되었으나, 그 다음해인 1961년에 메티실린 내성 황색포도알균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)이 출현하기 시작했다[2]. 합성 페니실린 계열인 옥사실린(Oxacillin)이 현재 메티실린 대신 사용되고 있는데, 국내 3차 병원에서 분리된 황색포도알균의 옥사실린 내성률은 60-75%로 나타나고 있고, 국내 요양 병원에서의 내성률은 80% 정도로 확인되고 있다[1].
MRSA의 출현으로 인한 MRSA 감염증 치료에 반코마이신(Vancomycin)이 사용되었으나 반코마이신 중등도 내성 황색포도알균(Vancomycin-intermediate S. aureus, VISA)이 1996년에 일본에서 처음 분리되었고[2], 이 후 미국, 독일, 인도를 비롯하여 전 세계적으로 분리 보고되었으며[3], 한국에서는 2000년에 처음 보고되었다[4]. 외국의 경우 프랑스 0.07%, 미국 0.3-2.3%, 태국 0.8%, 일본 0.24%의 수준으로 보고되고 있으며[5], 반코마이신을 사용하지 않은 환자에게서 VISA가 분리된 사례도 보고되었다[6]. 2002년 미국 미시간(Michigan)에서 반코마이신 내성 황색포도알균(Vacomycin-resistant S. aureus, VRSA)이 최초로 분리된 이후 2014년에 13번째 사례가 미국에서 보고되었으나[7], 아직까지 국내에서는 VRSA가 보고된 적은 없다.
이 글에서는 2015년 VRSA 실험실 감시 결과를 소개하고 분리된 VISA의 분자유전학적 특성을 정리하였다.


Ⅱ. 몸 말

2015년에 표본감시기관 및 표본감시기관 이외에서 VISA로 의심되어 확인동정 시험이 의뢰된 분리주는 총 53주였고, 의뢰된 분리주를 확인동정한 후 단일집락을 증균하여 반코마이신에 대한 MIC를 한천배지 희석법(Agar dilution method), 액체배지 미량희석법(Broth microdilution method) 및 E-test 시험법으로 확인하였다. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015) 지침에 따라 한천배지 희석법과 액체배지 미량희석법으로 반코마이신 MIC ≤2 ㎍/㎖이면 감수성, 4-8 ㎍/㎖는 중등도 내성, ≥16 ㎍/㎖는 내성으로 판정하였고, E-test 시험법으로 MIC ≤2 ㎍/㎖이면 감수성, ≥3-8 ㎍/㎖이면 중등도 내성, ≥12 ㎍/㎖는 내성으로 판정하였다. 3가지 시험법 중 1가지 이상에서 중등도 내성으로 확인되면 VISA로 판정하였으며, 표준균주도 함께 실험하여 MIC 결과가 허용범위 내에 있는지 확인하였다. 그 결과 총 35주가 VISA로 확인되었고, 그외 17종의 항균제에 대한 감수성은 E-test 시험법과 디스크 확산법(Disc diffusion test)으로 확인하였다.
황색포도알균의 메티실린 내성은 mecA 유전자에 의해서 나타난다. mecA 유전자는 Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec)이라는 이동성 유전자 부위에 위치하는데, 대부분의 SCCmec은 I-IV형에 속한다. Accessory gene regulator (agr) operon은 hemolysin, exoprotein, exotoxin 등의 독성인자 발현에 관여하고 염기서열에 따라 4가지 종류로 분류된다(agr group I-IV). 독성유전자는 장독소(Staphylococcal enterotoxin) 유전자 9종(sea-see, seg-sej)과 발열, 혈압저하, 발적 등의 Staphylococcal Toxin Shock Syndrome (TSS)을 일으키는 독성 쇼크 증후군 독소(Toxic Shock Syndrome Toxin-1, TSST-1) 유전자 등이 보고되었다[8]. 따라서 VISA 분리주의 분자생물학적 특성을 확인하기 위해 SCCmec 형, agr 형, 장독소 9종(sea-see, seg-sej), TSST-1 유전자를 각각 multiplex PCR을 실시하여 확인하였다[9]. 또한 분리된 VISA간의 분자역학적 유연관계를 분석하기 위하여 7개의 House keeping gene (arcc, aroe, glpf, gmk, pta, tpi, yqil)을 이용하여 MultiLocus Sequence Type (MLST)을 분류하였으며, rep-PCR 법으로 fingerprinting pattern을 분석하여 분리주들의 유전형도 비교분석하였다.
2015년 VRSA 실험실 감시를 통해 확인동정된 VISA 총 35주의 반코마이신에 대한 MIC 확인 결과, 한천배지 희석법과 액체배지 미량희석법에서 10주가 MIC 4 ㎍/㎖이었고, E-test 시험법에서는 27주가 MIC 3 ㎍/㎖, 8주는 MIC 4 ㎍/㎖를 나타내었다(Table 1).

16가지 항균제에 대한 감수성 시험결과 vancomycin과 같은 glycopeptide 계열의 다른 항균제 teicoplanin에 대해서는 1주가 중등도 내성으로 확인되었다. β-lactam 계열의 항균제인 penicillin, ampicillin, oxacillin, cefazolin에서는 모두 내성으로 확인되었다. Non-β-lactam 계열의 항균제 중 gentamicin에서는 23주, rifampicin에서는 19주, tigecycline에서는 6주, Daptomycin에서는 4주, tetracycline에서는 34주, ofloxacin, clindamycin, erythromycin에서는 35주가 내성으로 확인되었으며 trimethoprim/sulfamethoxazole, linezolid, quinupristin/dalfopristin에서는 모두 감수성으로 확인되었다(Table 2).

분리된 35주의 VISA 유전자 분석 결과 35주 모두 SCCmec II형, agr II 형으로 확인되었고 TSST-1 유전자도 모두 검출되었다. 장독소 유전자는 31주가 sec, seg, sei 유전자를, 3주는 sea, sec, seg, sei 유전자를 갖고 있었으며 1주는 장독소 유전자를 갖지 않는 것으로 확인되었다. MLST 분석 결과에서도 35주 모두 ST5로 확인이 되었다(Table 3).

35주의 VISA 분리주로 분자역학적 연관성을 분석하기 위하여 rep-PCR을 통해 기존에 보고된 클론들과 함께 유사성을 분석한 결과, 1주를 제외한 34주의 VISA는 모두 같은 패턴을 보이며 95%이상의 상동성을 나타냈고, 35주 모두 기존 보고된 USA100 및 USA800 클론과 유사한 특징을 보였다(Figure 1). USA100과 USA800은 각각 ST5-SCCmec II과 ST5-SCCmec IV형의 MRSA 클론인데, 미국내 병원감염 관련 MRSA 원인균으로 주로 확인되는 유전형이다.



Ⅲ. 맺는 말

VRSA는 현재 국내에서 분리되지 않았으나 VISA는 지속적으로 분리되고 있다[9]. 2015년에 분리된 VISA 35주를 대상으로 분자유전학적 특성을 조사한 결과 대부분의 VISA 분리주는 다제내성균이며, 유전학적으로 ST5형, SCCmec II형과 agr II형으로 확인되었다. 이는 국내에서 분리되는 MRSA가 대부분 SCCmec II형을 가진 ST5주(ST5-MRSA-SCCmec II)라는 기존 보고와도 일치하였다[9].
전 세계적으로 VRSA의 분리 사례는 많지 않지만, 미국뿐만 아니라 유럽지역에서도 2013년 처음으로 VRSA가 보고되었다[10]. 따라서 국내에서도 VRSA를 출현을 사전에 예방하고, 발생시 신속히 조치하기 위해서는 VISA에 대한 지속적인 감시와 특성 분석이 필요하다.


Ⅳ. 참고문헌

1. National Institute of Health, Korea Center for Disease Control and Prevention. Korean Antimicrobial Resistance Monitoring System (KARMS) Annual Report. 2014. p10.
2. Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 1997;40:135-6
3. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin-Illinois, 1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;48:1165-1167.
4. Kim MN, Pai CH, Woo JH, Ryu JS, Hiramatsu K. Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in Korea. J Clin Microbiol 2000;38:3879-81.
5. Song JH. Antimicrobial resistance in gram-positive cocci: Past 50 Years, present and future. Infect Chemother 2011;43:443-449.
6. Zhu X, Liu C, Gao S, Lu Y, Chen Z, Sun Z. Vancomycin intermediate-resistant Staphylococcus aureus(VISA) isolated from a patient who never received vancomycin treatment. Int J Infect Dis. 2015 Apr;33:185-90.
7. Limbago BM, Kallen AJ, Zhu W, Eggers P, McDougal LK, Albrecht VS. Report of the 13th vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from the United States. J Clin Microbiol. 2014 Mar;52(3):998-1002.
8. Kim JS, Kim HS, Song W, Cho HC, Lee KM, Kim EC. Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates with toxic shock syndrome toxin and staphylococcal enterotoxin C genes. Korean J Lab Med 2007;27:118-123.
9. Chung G, Cha J, Han S, Jang H, Lee K, Yoo J, Yoo J, Kim H, Eun S, Kim B, Park O, Lee Y. Nationwide surveillance study of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus strains in Korean hospitals from 2001 to 2006. J Microbiol Biotechnol 2010;20:637-642.
10. Melo-Cristino J, Resina C, Manuel V, Lito L, Ramirez M. First case of infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus in Europe. Lancet. 2013;382:9888.