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시험법

항생제 감수성 시험의 원칙

항생제 감수성 시험은 시험 균주의 오염, 부정확한 탁도 및 균주의 활성도 등에 따라 결과의 정확성이 떨어질 가능성이 있다. 따라서 매 시험마다 정확한 정도관리균주를 포함하여 시험하고, 정도관리 균주의 결과를 가장 먼저 확인한다. 정도관리 균주(51-53쪽 참조)의 결과가 허용 범위를 벗어난 경우는 해당 시험 결과를 신뢰할 수 없으므로 재실험을 시행한다.

  • 16-24시간 순배양된 집락 사용
  • 항생제 감수성 시험에 사용하는 세균은 반드시 순수 배양된 집락을 사용해야 하며, 16-24시간 배양한 집락을 이용한다.
  • 항생제 감수성 시험용 배지의 관리
  • 항생제 감수성에 사용하는 배지는 구입 후에 반드시 정도관리를 시행
감수성 시험 대상 항생제 선택

감수성 시험 대상인 항생제는 다음의 원칙에 따라 선택하였다.

가. Kor-GLASS 조사 대상 항생제

나. WHO에서 2017년에 제안한 Integrated surveillance of AMR in foodborne bacteria 지침에서 제안한 항생제
(http://www.who.int/foodsafety/areas_work/antimicrobial-resistance/integrated/en/) 새창열기

축산 및 동물영역에서 사용되는 항생제의 종류 이미지
| Figure Ⅲ-2 | 축산 및 동물영역에서 사용되는 항생제의 종류 (%)
항생제 감수성시험

가. 디스크 확산법

5-15-15 규칙 준수

  • 정확한 항균제 감수성 시험을 위해서는 15-15-15 규칙을 준수한다.
  • 균액 제조 후 15분 이내 배지 접종-배지 접종 후 15분 이내 디스크 접종-디스크 접종 후 15분 이내 배양 시작)
  1. 시험방법
    • 가) 세균 부유액 준비
      • 시험할 집락을 멸균 식염수(saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)
      • 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
    • 나) 배지
      • 배지는 시험 항생제의 숫자에 따라 Mueller-Hinton 한천배지 90 mm와 150 mm 크기를 사용한다. 배지의 두께는 중심부부터 가장 자리까지 4 mm로 일정하게 유지되어야 한다.
    • 다) 접종
      • 면봉에 균액을 묻히고 과량의 액체는 면봉을 시험관 벽에 대고 돌려 제거한 후에 접종한다(균액을 만들고 15분 이내에 접종). 균액은 배지를 120°씩 돌려서 3번을 바르도록 한다.
    • 라) 디스크 놓기 (Applicator 사용)
      • 균액을 접종하고 3-5분 후에 물기가 마르면 디스크를 놓고, 떨어진 디스크는 이동을 금지한다(균액 접종 후 15분 이내에 항생제 디스크 접종).
    • 마) 디스크까지 접종한 배지는 15분 이내에 배양기에 넣고 35℃에 16-18시간 배양 한다(Vancomycin은 24시간 배양).
      균액 접종방법 이미지버어니어 캘리퍼스
      | Figure Ⅳ-2 | 균액 접종방법 및 버어니어 캘리퍼스

      | Figure Ⅳ-2 | One Health 항생제 내성균 연구 대상 항생제 및 시험 방법
      항생제 감수성시험법중 One Health 항생제 내성균 연구 대상 항생제 및 시험 방법 정보 표
      Antibiotics SA SE SI EF EM EC KP CI EN PA AB SL SH CA1
      Penicillin DDDD
      Oxacillin D
      Ampicillin DDDBDBD
      Piperacillin DDDDDD
      Amoxicillin-clavulanic acid DDDD
      Ampicillin-sulbactam DDDD
      Piperacillin-Tazobactam D
      Cefazolin DDD
      Cefotaxime DDDDBDBD
      Ceftriaxone BDBD
      Ceftazidime DDDDDDBDBD
      Cefepime DDDDDD
      Cefoxitin DDDDDBDBD
      Aztreonam DDDD
      Ertapenem DDDD
      Imipenem D, ADD, ADD, ADD, ADDDBDBD
      Meropenem D, ADD, ADD, ADD, ADDD
      Erythromycin DDDD
      Azithromycin BDBD
      Clindamycin DDD
      Quinupristin-dalfopristin DDDD
      Amikacin DDDDDDBDBD
      Gentamicin DDDDDDDDDBDBD
      Streptomycin BDBD
      Tobramycin DDDDDD
      Gentamicin-High Level DD
      Streptomycin-High Level DD
      CiprofloxacinDDDDDDDDBDBDD
      Nalidixic acid DDDDBDBD
      Tetracycline DDDDDDDDDDBDBDD
      Minocycline D
      Tigecycline EEEEEDDDDD
      Vancomycin EEEEE
      Teicoplanin EEEEE
      Trimethoprime- sulfamethoxazole DDDDDDDBDBD
      Mupirocin DDD
      Linezolid EEEEE
      Chloramphenicol DDDDDDDDDBDBD
      Nitrofurantoin DDDDDD
      Rifampicin DDD
      Colistin BDBDBDBDBDBDBDBD
      출처
      * Abbreviations: AD, agar dilution method; BD, broth microdilution method; D, Disk diffusion method; E, Etest; SA, S. aureus; SE, S. epidermidis; SI, S. pseudintermedius; EF, E. faecalis; EM, E. faecium; EC, E. coli; KP, K. pneumoniae; CI, Citrobacter spp.; EN, Enterobacter spp.; PA, P. aeruginosa; AB, Acinetobacter spp.; SL, Salmonella spp.; SH, Shigella spp.; CA, Campylobacter spp.
      *** 위첨자1 1 Campylobacter 균종은 Blood MHA 배지를 사용하여 O2 5%, CO2 10%, N2 85% 환경에서 42°C 24시간 배양
  2. 판독
    • 가) Biomic 장비 또는 버어니아 캘리퍼스를 이용하여 판독하며, 정도관리 균주부터 우선적으로 결과를 점검한다. 시험관리가 실패한 경우는, 원인을 규명하고 해결한 후에 해당 시기의 감수성 시험을 재시험한다.
    • 나) 30cm 떨어져서 육안으로 보아 증식이 완전히 억제된 곳까지의 지름을 재는 것이 원칙이지만 cotrimoxazole 및 linezolid 등은 증식이 80% 및 90% 억제된 곳까지 측정한다. Vancomycin은 억제대 모양과 억제대 내부의 집락을 주의 깊게 관찰한다.
      Enterococcus spp.에 대한 억제 구역의 예
      • a) 시험할 집락을 멸균 식염수(saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)
      • b-d) 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
    • 다) Biomic 장비 또는 이에 준하는 장비로 판독한 경우는, 장비에서 설정한 억제대의 지름이 정확한 지 여부를 육안으로 확인한 후에 결과를 저장한다. 장비에서 설정한 억제대 지름이 틀렸을 경우는 매뉴얼 기능을 사용하여 억제대 지름을 재설정한 후에 결과를 판독한다. 판독이 끝난 평판배지의 사진을 재해석에 대비하여 모두 장비에 저장하고, 매달 별도의 매체에 백업한다(외장 하드디스크 또는 DVD).
    • 라) Biomic 장비 또는 이에 준하는 장비로 판독한 경우에 소숫점 이하의 결과가 나오는 경우는 반올림 또는 반내림을 시행하여 결과를 해석한다. 억제대가 보이지 않는 경우는 6 mm로 결과를 입력한다.
  3. 디스크 확산법 검사시 주의사항
    • 가) 감수성 검사의 결과는 여러 가지 요소에 의해 달라지므로 원법에 충실히 따르도록 한다.
    • 나) 냉동된 병에서 디스크를 꺼낼 때는 유효기간이 가까운 것부터 사용
    • 다) 항생제 디스크를 꺼내고 나서는 병마개를 꼭 막아서 습기 방지 (흡습제)
    • 라) 사용 중인 디스크는 용기에 넣고 뚜껑을 닫아서 습기 방지
    • 마) 사용 중인 디스크가 시험관리 범위를 벗어나면 즉시 보고
    • 바) 같은 세균이라고 확신할 경우가 아니면 여러 집락을 섞어서 시험하지 말 것
  4. 균종별 시험항생제 및 판독기준

    균종별로 적용 가능한 판독 기준은 미국의 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M100-S27 Peformance standards for antimicrobial susceptibility testing (2017)을 적용하였고, 판독 기준이 없는 일부 항균제는 유럽의 The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 7.1, (2017)을 적용하였다 (EUCAST 표시). S. epidermidis 및 S. pseudintermedius의 mupirocin 판독기준은 EUCAST의 S. aureus 기준을 적용하였다.

    항생제 감수성시험법중 디스크 확산법의 균종별 시험항생제 및 판독기준 정보 표
    균종 항생제 용량(µg) 판독기준(mm)
    ≥S I ≤R
    S. aureus Penicillin 10U 29 28
    Cefoxitin 30 22 21
    Erythromycin 15 23 14-22 13
    Clindamycin 2 21 15-20 14
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Quinuprisitn-dalfopristin 15 19 16-18 15
    Tetracycline 30 19 15-18 14
    Mupirocin (EUCAST) 200 30 18-29 17
    Cholramphenicol 30 18 13-17 12
    Rifampicin 5 20 17-19 16
    S. epidermidis Penicillin 10U 29 28
    Cefoxitin 1 25 24
    Erythromycin 15 23 14-22 13
    Clindamycin 2 21 15-20 14
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Quinuprisitn-dalfopristin 15 19 16-18 15
    Tetracycline 30 19 15-18 14
    Mupirocin (EUCAST) 200 30 18-29 17
    Cholramphenicol 30 18 13-17 12
    Rifampicin 5 20 17-19 16
    S. pseudintermedius Penicillin 10U 29 28
    Oxacillin 30 18 17
    Erythromycin 15 23 14-22 13
    Clindamycin 2 21 15-20 14
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Quinuprisitn-dalfopristin 15 19 16-18 15
    Tetracycline 30 19 15-18 14
    Mupirocin (EUCAST) 200 30 18-29 17
    Cholramphenicol 30 18 13-17 12
    Rifampicin 5 20 17-19 16
    E. faecium Penicillin 10U 15 14
    Ampicillin 10 17 16
    Gentamicin (High level) 120 10 7-9 6
    Streptomycin (High level) 300 10 7-9 6
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Tetracycline 30 19 15-18 14
    Cholramphenicol 30 18 13-17 12
    Nitrofurantoin 300 17 15-16 14
    E. faecalis Ampicillin 10 17 16
    Gentamicin (High level) 120 10 7-9 6
    Streptomycin (High level) 300 10 7-9 6
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Tetracycline 30 19 15-18 14
    Quinuprisitn-dalfopristin 15 19 16-18 15
    Cholramphenicol 30 18 13-17 12
    Nitrofurantoin 300 17 15-16 14
    E. coli Ampicillin 10 17 14-16 13
    Piperacillin 100 21 18-20 17
    Ampicillin-sulbactam 10/10 15 12-14 11
    Amoxillin-clavulanate 20/10 18 14-17 13
    Cefazolin 30 23 20-22 19
    Cefotaxime 30 26 23-25 22
    Ceftazidime 30 21 18-20 17
    Cefepime 30 25 19-24 18
    Aztreonam 30 21 18-20 17
    Cefoxitin 30 18 15-17 14
    Imipenem 10 23 20-22 19
    Meropenem 10 23 20-22 19
    Ertapenem 10 22 19-21 18
    Amikacin 30 17 15-16 14
    Gentamicin 10 15 13-14 12
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Naldixic acdi 30 19 14-18 13
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Tetracycline 30 15 12-14 11
    Tigecycline (EUCAST) 15 18 17-15 14
    Chloramphenicol 30 18 13-17 12
    Nitrofurantoin 300 17 15-16 14
    K. pneumoniae Piperacillin 100 21 18-20 17
    Ampicillin-sulbactam 10/10 15 12-14 11
    Amoxillin-clavulanate 20/10 18 14-17 13
    Cefazolin 30 23 20-22 19
    Cefotaxime 30 26 23-25 22
    Ceftazidime 30 21 18-20 17
    Cefepime 30 25 19-24 18
    Aztreonam 30 21 18-20 17
    Cefoxitin 30 18 15-17 14
    Imipenem 10 23 20-22 19
    Meropenem 10 23 20-22 19
    Ertapenem 10 22 19-21 18
    Amikacin 30 17 15-16 14
    Gentamicin 10 15 13-14 12
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Naldixic acdi 30 19 14-18 13
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Tetracycline 30 15 12-14 11
    Tigecycline (EUCAST) 15 18 17-15 14
    Chloramphenicol 30 18 13-17 12
    Nitrofurantoin 300 17 15-16 14
    Citrobacter spp. Piperacillin 100 21 18-20 17
    Ampicillin-sulbactam(C. freundii 자연내성) 10/10 15 12-14 11
    Amoxillin-clavulanate 20/10 18 14-17 13
    Cefazolin 30 23 20-22 19
    Cefotaxime 30 26 23-25 22
    Ceftazidime 30 21 18-20 17
    Cefepime 30 25 19-24 18
    Aztreonam 30 21 18-20 17
    Cefoxitin 30 18 15-17 14
    Imipenem 10 23 20-22 19
    Meropenem 10 23 20-22 19
    Ertapenem 10 22 19-21 18
    Amikacin 30 17 15-16 14
    Gentamicin 10 15 13-14 12
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Naldixic acdi 30 19 14-18 13
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Tetracycline 30 15 12-14 11
    Tigecycline (EUCAST) 15 18 17-15 14
    Chloramphenicol 30 18 13-17 12
    Nitrofurantoin 300 17 15-16 14
    Enterobacter spp. Piperacillin 100 21 18-20 17
    Amoxillin-clavulanate 20/10 18 14-17 13
    Cefotaxime 30 26 23-25 22
    Ceftazidime 30 21 18-20 17
    Cefepime 30 25 19-24 18
    Aztreonam 30 21 18-20 17
    Imipenem 10 23 20-22 19
    Meropenem 10 23 20-22 19
    Ertapenem 10 22 19-21 18
    Amikacin 30 17 15-16 14
    Gentamicin 10 15 13-14 12
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Naldixic acdi 30 19 14-18 13
    Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 16 11-15 10
    Tetracycline 30 15 12-14 11
    Tigecycline (EUCAST) 15 18 17-15 14
    Chloramphenicol 30 18 13-17 12
    Nitrofurantoin 300 17 15-16 14
    P. aeruginosa Piperacillin 100 21 15-20 14
    Piperacillin-tazobactam 100/10 21 15-20 14
    Ceftazidime 30 18 15-17 14
    Cefepime 30 18 15-17 14
    Imipenem 10 19 16-18 15
    Meropenem 10 19 16-18 15
    Amikacin 30 17 15-16 14
    Gentamicin 10 15 13-14 12
    Tobramycin 10 15 13-14 12
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Acinetobacter spp. Piperacillin 100 21 18-20 17
    Ampicillin-sulbactam 10/10 15 12-14 11
    Ceftazidime 30 18 15-17 14
    Cefepime 30 18 15-17 14
    Imipenem 10 22 19-21 18
    Meropenem 10 18 15-17 14
    Amikacin 30 17 15-16 14
    Gentamicin 10 15 13-14 12
    Tobramycin 10 15 13-14 12
    Ciprofloxacin 5 21 16-20 15
    Tetracycline 30 15 12-14 11
    Minocycline 30 16 13-15 12
    Tigecycline (EUCAST) 15 18 17-15 14
    Campylobacterspp. Erythromycin 15 16 13-15 12
    Ciprofloxacin 5 24 21-23 20
    Tetracycline 30 26 23-25 22

나. Etest

  1. 시험방법 : 디스크확산법과 동일
    • 가)세균 부유액 준비
      • 시험할 집락을 식염수 (saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)
      • 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
    • 나) 배지

      시험 항생제의 숫자에 따라 Mueller-Hinton 한천배지 90mm와 150mm 크기를 사용한다. 배지의 두께는 중심부부터 가장 자리까지 4mm로 일정하게 유지되어야 한다.

    • 다) 접종

      면봉에 균액을 묻히고 과량의 액체는 면봉을 시험관 벽에 대고 돌리어 짜낸 후에 접종한다 (균액을 만들고 15분 이내에 접종). 균액은 배지를 120°씩 돌려서 3번을 바르도록 한다.

    • 라) Etest 스트립 놓기

      균액을 접종하고 3-5분 후에 물기가 마르면 스트립을 놓고, 떨어진 스트립은 이동을 금지한다(균액 접종 후 15분 이내에 스트립 접종).

    • 마) 스트립까지 접종한 배지는 15분 이내에 배양기에 넣고 35℃에 16-18시간 배양한다(Vancomycin은 24시간 배양).
  2. 판독
    • 가)항생제 스트립과 억제대가 만나는 지점의 농도를 최소억제농도로 판정하며, 2개의 농도 사이에 억제대가 있으면 높은 농도로 판독한다.
      항생제 스트립과 억제대가 만나는 지점의 농도 표시 이미지
    • 나) Linezolid, tigecycline 같은 bacteriostatic antibiotic은 증식 억제가 처음 관찰되는 80% 또는 90% 억제대를 판독한다.
      Linezolid, tigevycline 같은 bacteriostatic antibiotic의 증식 억제가 관촬되는 농도 표기 이미지 Linezolid, tigevycline 같은 bacteriostatic antibiotic의 증식 억제가 관촬되는 농도 표기 이미지
    • 다) 억제대 안에 집락이 있으면 집락이 있는 지점까지 농도를 올려서 판독한다.
      억제대 안에 집락이 있으면 집락이 있는 지점까지 농도를 올려서 판독한다.
    • 라) 좌우의 농도가 다른 경우는 높은 농도로 판독하고 2단계 이상 차이나는 경우는 재시험한다.
      디스크 확산법 농도 차이 표기 이미지 디스크 확산법 농도 차이 표기 이미지 디스크 확산법 농도 차이 표기 이미지
    • 마) 용혈이 있는 경우는 용혈대를 판독하지 않도록 주의한다.
      응혈이 있는경우 판독 오류 정정 표기 이미지
    • 바) Vancomycin과 teicoplanin의 경우에 타원형의 골짜기 억제대가 생기는 경우는 가장 낮은 억제대 농도를 판독한다.
       Vancomycin과 teicoplanin의 경우 판독 위치 표기 이미지
  3. 균종별 시험항생제 및 판독기준
    항생제 감수성시험법 중 ETest 균종별 시험항생제 및 판독기준 정보 표
    균종 항생제 판독기준(µg/mL)
    ≥S I ≤R
    S. aureus Vancomycin 2 4-8 16
    Teicoplanin 8 16 32
    Linezolid 4 NA 8
    Tigecycline (EUCAST, BMD) 0.5 NA 1
    S. epidermidisS. pseudintermedius Vancomycin 4 8-16 32
    Teicoplanin 8 16 32
    Linezolid 4 NA 8
    Tigecycline (EUCAST, BMD) 0.5 NA 1
    E. faeciumE. faecalis Vancomycin (24hr incubation) 4 8-16 32
    Teicoplanin 8 16 32
    Linezolid 2 4 8
    Tigecycline (EUCAST, BMD) 0.25 0.5 1

다. 액체배지 미량희석법

  1. 시험방법
    • 가) Salmonella 균종과 Shigella 균종의 항생제 감수성을 위해서는 주관 부서와 협의하여 국립보건연구원에서 사용 중인 Sensititre (Thermo-Fisher Scientific, USA)의 항생제 감수성 검사 패널을 사용한다.
    • 나) 시험할 집락을 식염수(saline)에 접종 (반드시 1개의 집락만을 선택하여 시험하고, 집락의 크기가 작아서 부득이한 경우는 최대한 동일 형태의 집락을 선택)하고, 식염수를 써서 균액의 탁도를 McFarland의 0.5에 맞춘다(표준 탁도시험관 비교 또는 탁도계 사용).
    • 다) 패널에 균액을 희석하여 well 당 5 X 105 CFU/mL이 되도록 희석하여 접종하고 18-24시간 37°C 배양기에서 배양한다.
  2. 판독방법
    • 가) 시험관리용 well을 먼저 확인하여 양성 대조 및 음성 대조의 증식 여부를 확인 점검한다.
    • 나) 판독 원칙은 세균의 증식이 억제된 well의 농도를 최소억제농도로 판독한다.
    • 다) Trimethoprim-sulfamethoxazole은 80% 억제된 well을 최소억제농도로 판독한다.
    • 라) Trailling end point (Linezolid 등)를 보이는 경우는 trailing이 시작된 첫 번째 well을 판독한다.
    • 마) 중간에 증식이 건너 뛴 well이 있는 경우는 억제가 있는 가장 높은 농도를 보고하고, 2개 이상의 well에서 건너 뛴 경우는 해당 균주를 재실험한다.
      액체배지 미량 희석법 판독법 표기 이미지
      | Figure Ⅳ-2 | Linezolid: Trailing End Points (B8-B12, 16-1 ㎍/㎖), MIC=B10
  3. 균종별 시험항생제 및 판독기준
    항생제 감수성시험법중 액체배지 미량희석법 균종별 시험항생제 및 판독기준 정보 표
    균종 항생제 판독기준(µg/mL)
    ≥S I ≤R
    Salmonellaspp. Ampicillin 8 16 32
    Cefotaxime 1 2 4
    Ceftriaxone 1 2 4
    Ceftazidime 4 8 16
    Cefoxitin 8 16 32
    Imipenem 1 2 4
    Ciprofloxacin 0.06 0.12-0.5 1
    Nalidixic acid (EUCAST) NA NA NA
    Amikacin 16 32 64
    Gentamicin 4 8 16
    Streptomycin NA NA NA
    Tetracycline 4 8 16
    Trimethoprim-Sulfamethoxazole 2/38 NA 4/76
    Azithromycin (S. Typhi only) 16 NA 32
    Colistin 2 NA 4
    Shigellaspp. Ampicillin 8 16 32
    Cefotaxime 1 2 4
    Ceftriaxone 1 2 4
    Ceftazidime 4 8 16
    Cefoxitin 8 16 32
    Imipenem 1 2 4
    Ciprofloxacin 1 2 4
    Nalidixic acid 16 NA 32
    Amikacin 16 32 64
    Gentamicin 4 8 16
    Streptomycin NA NA NA
    Tetracycline 4 8 16
    Trimethoprim-Sulfamethoxazole 2/38 NA 4/76
    Azithromycin (S. flexneri, ECOFF) 8 NA 16
    Azithromycin (S. sonnei, ECOFF) 16 NA 32
    Colistin 2 NA 4