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One Health 항생제 내성균 조사연구 사업 수집균주 보관

One Health 항생제 내성균 조사연구 사업 수집균주에 대한 보관기관별 보관형태 정보 표
보관 기관 보관 형태
연구 수행 기관 (세부과제 기관 포함) 1 skim milk
질병관리청 주관부서 (약제내성연구과) 1 skim milk
1 microbank

※ 시험관리를 진행하지 않는 과제에서는 bead만 발송

시험관리 체계

시험관리 체계(3)

  • One Health 항생제 내성균 조사연구 사업의 균주 수집기관(6개 과제)을 통해 수집된 균주는 skim milk stock 2개와 bead stock 1개로 보관된다.
  • 2개의 skim milk stock 중 1개는 균주 수집기관에서 자체 보관하며, 다른 1개는 0.1ml씩 2개로 분주되어 시험관리센터 및 질병관리청으로 각각 발송되어 시험관리를 수행하게 된다.
  • 균주 수집기관은 시험관리 종료 후 월별 수집 균주의 skim milk stock 1개와 bead stock 1개를 질병관리청 약제내성연구과로 송부하여야 한다.
  • 시험관리용으로 사용된 stock은 남은 양(0.8ml)으로 그대로 발송한다.
| Figure Ⅷ-1 | 시험관리 체계(3)

Skim milk 균주 보관법

가. 균주의 보관

  1. 10-20% 농도로 사용 (일반적인 세균 10%, 영양요구도 큰 세균 20%)
  2. 배지의 준비
    • ① 100 g 배지 power를 1 L purified water 용해한다(필요시 가열).
    • ② 보관 tube에 1 mL 씩 분주한다.
    • ③ 121℃, 15분간 autoclave한다.
    • ④ 냉동 보관한다(사용 전에 냉장 보관 후 실온화).
  3. 균주 접종
    • ① 가급적 증균 배지에 접종하여 준비한다.
    • ② 18-24시간 배양한 집락을 사용한다(특히 fastidious organism).
    • ③ 접종하기 전에 집락 모양을 관찰하여 순수 배양 여부를 확인한다.
    • ④ 멸균된 루프를 사용하여 (알코올 램프 또는 전기 멸균기 사용시 주의), 배지의 바닥을 긁지 않도록 주의하며 집락을 채취한다(오염 가능성).
    • ⑤ 집락은 대부분의 세균에서 1 루프 가득 채취한다
    • ⑥ 실온화한 skim milk에 채취한 세균을 집락이 완전히 풀리도록 접종한다.
    • ⑦ 마개를 밀봉하고 –70℃ 보관한다.

나. Skim milk 보관 균주의 배양

  1. 계대 배양할 skim milk 배지를 선택한다.
  2. 균주 배양
    • ① 멸균된 루프를 준비한다(열소독을 했을 경우는 루프를 충분히 식힌다).
    • ② 1 루프 정도 되도록 냉동된 skim milk 배지를 긁어낸다.
    • ③ 루프에 있는 냉동 배지를 배지에 접종한다(한천 배지의 경우는 루프로 streaking 시행한다).
    • ④ 냉동 skim milk 배지는 가능한 빨리 냉동고에 저장한다.

Microbank 균주 보관법(Pro-Lab Diagnostics, Round Rock, TX

가. 균주의 보관

  1. 세균 및 진균의 장기 보관을 위한 제품
  2. 배지의 준비: 제품 구성 (80 vials)
    • ① Porous glass beads
    • ② Formulated cryopreservative at low temperature
    • ③ 사전 준비물 (BSC 내부에서 작업 시행)
    • ④ 접종용 루프
    • ⑤ 멸균된 면봉
    • ⑥ McF 표준 탁도계
    • ⑦ 멸균된 1회용 pipette
  3. 균주 접종
    • ① Microbank 라벨 부분에 균주 번호를 표시한다.
    • ② 무균 상태에 주의하며, microbank 마개 개봉한다.
    • ③ 순수 배양된 보관 균주 준비한다(18-24시간 배양한 집락 사용).
    • ④ 멸균된 루프 또는 면봉을 사용하여 충분한 양의 세균을 채취한다.
    • ⑤ Microbank tube 내의 Cryopreservative에 접종한다(McF 3-4).
    • ⑥ 무균 상태에 주의하며, microbank 마개를 밀봉한다.
    • ⑦ 균액이 잘 섞이도록 4-5회 위-아래를 뒤집어 혼합한다(Vortex는 사용하지 않는다).
    • ⑧ 세균이 bead에 잘 붙도록 2분간 방치한다.
    • ⑨ 마개를 다시 열어 멸균된 pipette으로 여분의 cryopreservative 제거한다(가능한 액체 성분이 bead에 남지 않도록 충분히 제거).
    • ⑩ 마개를 밀봉하고 –70℃ deep freezer에 장기 보관한다.

가. Microbank 보관 균주의 배양

  1. 계대 배양한 microbank 선택
  2. 균주 배양
    • ① -70℃ 장기 보관된 microbank를 선택한다.
    • ② 무균 상태에 주의하며, 마개를 개봉한다.
    • ③ 멸균된 needle 또는 forcep을 사용하여 bead 1개를 선택한다.
    • ④ Microbank 마개 밀봉 후 가능한 빨리 –70℃ 보관한다.
    • ⑤ Bead를 사용하여 배지 표면에 접종 또는 액체 배지 접종한다(사용한 bead는 폐기, 절대로 microbank에 재보관 불가).
      MicrBank 사용 방법 상세내용 아래참조

      Micrbank 사용 방법

      • 1. Inoculate the cryopreservative with colonial growth (18-24 hours) from pure culture.
      • 2. Close Vial tightly and invert 4. 5 times to emulsify organism. Do not vortex
      • 3. Aspirate excess cryopreservative using sterile pipette
      • 4. Store inoculated cryovial in appropriate freezer or liquid nitrogen.
      • 5. Recover inoculated beads under aseptic conditions using a sterile needle or forceps.
      • 6. The bead may then be used to inoculate appropriate solid or liquid media
      | Figure Ⅷ-2 | Micrbank 사용 방법