Abstract

Genetic diversity of Vibrio vulnificus strains isolated in Korea

Hong Sa-hyun, Jung Su-Mi, Yun Young Sun, Na Hae-Young, Kang Byung Haek, Kim Jae Ok
Division of Bacterial Diseases, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC

Background: Vibrio vulnificus is a pathogenic bacterium naturally occurring in coastal and estuarine water worldwide that can cause life-threatening diseases by wound infection or food poisoning. The genetic background of V. vulnificus isolates thriving in Korea remains undefined.
Methodology: In this study, 42 isolates (25 clinical and 17 environmental) were considered for examining their genetic relationship and diversity in Korea between 2014 and 2015. Multilocus sequence typing (MLST) method was used to study the prevalence and population structure of clinical strains. PCR conditions of the ten housekeeping genes and sequence type (ST) determination of all isolates were followed as described in PubMLST. Conventional PCR assay was performed to determine the presence of vvhA and rtxA genes and for 16S rRNA typing. Genetic diversity analysis was carried out using the MEGA 6 software. Based on the related STs, the isolates were analyzed by neighbor-joining method.
Results: The 42 tested isolates belonged to 40 STs, each of which was new to the MLST database. The nucleotide diversity ranged from 0.017 (pntA) to 0.036 (lysA), and presented the largest number of variable sites (9.25%). Clinical and environmental (sea water) strains were distinguished by neighbor-joining tree constructed from STs.
Conclusion: Forty-two V. vulnificus clinical isolates showed 40 different STs, which were stored in PubMLST as new STs, suggesting a high level of genetic diversity. These results revealed genetic differences between the clinical and environmental strains.

Keywords: Vibrio vulnificus, Multilocus sequence typing (MLST), Housekeeping genes, Genetic diversity, Foodborne diseases



들어가는 말

비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)은 호염성 세균으로 운동성이 있는 그람음성 간균이며, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 장염 비브리오균(Vibrio parahaemolyticus) 등과 함께 해안지역에 광범위하게 분포되어 있다고 알려져 있다[1]. 비브리오 패혈증균은 간 기능이 저하되었거나 기저질환으로 면역기능이 저하된 환자에서 심각한 패혈증을 일으키는 비브리오 패혈증의 원인균으로 보고되어있다[2,3]. 비브리오 패혈증은 원인균에 의한 상처감염이나 조리하지 않은 오염된 해산물 섭취로 발병하고, 피부괴사를 일으키며 치명률은 50% 이상으로 높게 보고되고 있다[4]. 해수온도가 15°C 이상으로 상승하는 초여름부터 활발하게 증식하며, 이에 따라 여름부터 늦가을까지 해양 생태계에 존재한다[5]. 비브리오 패혈증균의 병원성 요소로 vvhA, rtxA 등의 독소유전자들이 알려져 있으며, 임상분리주와 환경분리주간에 16S rRNA의 sequence polymorphism이 존재한다는 사실이 알려져 있어, 이에 따라 Mutiplex PCR을 이용한 16S rRNA 유전자의 증폭산물에 따라 임상형(Clinical type)과 환경형(Environmental type)을 구분하는 분자역학적 분류방법 등이 알려져 있다[6-8]. 비브리오 패혈증균의 생물형은 세 종류이다. 생물형 1은 사람이나 환경에서 주로 발견되는 균주로 사람에게 질병을 유발시킨다. Indole과 ornithine 탈탄산효소 양성이다. 생물형 2는 비브리오 패혈증균에 감염된 뱀장어에서 처음 분리되었고 indole과 ornithine 탈탄산효소를 생산하지 않는다. 생물형 3은 동일한 증상으로, 양식에서 자란 물고기(tilapia, 아프리카 동남부가 원산인 민물고기)에 노출되어 감염된 환자의 상처부위와 패혈증을 일으킨 혈액에서 분리 보고되었고 이스라엘에서만 보고되었다[9].
이 글에서는 2014년부터 2015년까지 2년간 국내 각 지역에서 발생한 패혈증 환자로부터 분리된 비브리오 패혈증균과 해양환경(해수)에서 분리된 비브리오 패혈증균을 대상으로 생물형과 16S rRNA 유전자 typing, Multilocus sequence typing(MLST)법으로 유전형을 분석하고 독소유전자의(rtxA) 유무를 파악하여 국내에 유행하는 균주의 유전적 특성을 파악하고자 하였다.



몸 말

연구에 사용된 균주는 2년간(2014～2015년) 전국의 비브리오 패혈증 환자로부터 분리된 25주의 비브리오 패혈증균과 동일기간 해안가의 해양환경(해수)으로부터 분리된 17주의 비브리오 패혈증균 총 42균주를 대상으로 하였다. 패혈증균을 분리하기 위해 환자의 대변 또는 직장도말에서 대변 검체를 채취한 후 TCBS(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar)와 Chrom agar Vibrio 선택배지에 접종하여, 각각 짙은 녹색과 옅은 파란색을 나타내는 집락을 선별하였다[9]. API20E kit를 이용한 생화학적 검사와 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 종 특이 유전자(Vibrio vulnificus haemolysin A, vvhA) 보유 여부를 확인하는 분자생물학적 검사를 통하여 비브리오 패혈증균을 동정하였다[10].
또한, API20E kit 결과에서 실험에 사용된 42균주는 indole을 생산하는 생물형 1형임을 확인하였다. 유전형 분석법으로 다양한 분자생물학적 분석법 중 MLST는 분리 균주들의 ST(Sequence type)와 CC(Clonal complex) 정보를 공유할 수 있어 균종들의 역학적 기원 및 진화적 배경들을 추정할 수 있다는 장점이 있다. 비브리오 패혈증균 MLST 실험법은 PubMLST 웹사이트(http://www.pubmlst.org/vulnificus)에 제시된 방법에 따라 10개의 housekeeping 유전자 glp, gyrB, mdh, metG, purM(ChromosomeⅠ), dtdS, lysA, pntA, pyrC, tnaA(ChromosomeⅡ)를 PCR로 증폭하고 염기서열을 분석하였으며, PubMLST 데이터베이스(DB)에서 새로운 유전자 염기서열에 대해서는 관련 정보와 함께 DB에 등록하였다(ST-290∼ST-364).
MLST 유전자별로 염기서열을 분석한 결과, 각 allele는 16～25가지 타입으로 나타났으며, variable site 수는 MEGA 6 software를 사용하여 14～32개 범위를 확인하였다(Table 1). 가장 많은 variable site를 가진 유전자는 chromosomeⅠ과 chromosomeⅡ에서 각각 480 bp 중 30개의 염기서열이 다른 glp와 465 bp 중 43개의 염기서열이 다른 lysA이었다. Nucleotide diversity도 마찬가지로 glp와 lysA 유전자가 각각 0.021, 0.036으로 다른 유전자들에 비해 높은 값을 보였다.
MLST 분석 결과, 국내 비브리오 패혈증균 42주는 40개의 ST로 확인되었으며, 이 중 40개가 새로운 유형이었다(Table 2). 한 가지 이상의 유형은 ST-294, ST-355 두 유형으로 나머지 균주는 각기 다른 sequence type이었다. 비브리오 패혈증균의 16S rRNA 증폭산물에 따른 분류에서는 임상 분리 균주 25주 중 21주(84.0%)가 임상형(Clinical type) 이었고 4주(16.0%)가 환경형(Environmental type) 이었다. 해수 분리 균주는 17주 중 12주(70.6%)가 임상형(Clinical type) 이었고, 5주(29.4%)가 환경형(Environmental type) 이었다. 한편, 독소 유전자 분석결과는 임상 분리 균주 25주 중 19주(76.0%)가 rtxA 유전자를 보유하고 있었고 해수 분리 균주는 17주 중 13주(76.5%)가 보유하고 있었다. vvhA 독소 유전자는 실험한 42주 모두 보유하고 있었다.
국내 비브리오 패혈증균이 나타낸 40개의 ST 간의 상관관계를 분리원에 따라(임상 분리 균주 : ●, 환경 분리 균주 : ○) Figure 1에 나타내었다. ST의 분석을 위해 MEGA 6에서 neighbor-joining 방법을 이용하여 tree를 그려 분석한 결과 두 가지 그룹으로 구분되었다. Cluster 1에 속한 ST는 환자 분리 균주(9주)와 환경 분리 균주(14주)를 포함하고 있었으며, cluster 2는 두 개의 ST를 제외하고 모두 환자로부터 분리된 임상 분리 균주였다.



맺는 말


이 연구에서는 국내 패혈증 환자와 해수에서 분리된 비브리오 패혈증균에 대한 생물형, 16S rRNA type, 독소유전자(rtxA) 존재 유무, MLST 유형 분석을 통해 국내 유행 균주의 양상을 파악하고자 하였다. 분리된 모든 균주는 생물형 1에 속했으며, MLST 균주유형은 ST-110∼364 등 40개 ST로 기존의 DB에 등록되어 있지 않는 유형으로 각 균주 당 새로운 ST형을 부여받음으로써 국내 분리 비브리오 패혈증균의 유전적 배경이 매우 다양함을 알 수 있었다. MLST 균주 유형은(ST) 임상과 해양 환경 분리원에 따라 부분적으로 두 개의 그룹으로 구분됨을 알 수 있었다(환경 분리 균주와 임상 분리 균주가 혼재되어 있는 그룹과 대부분이 임상 분리 균주인 그룹). 이는 임상에서 분리되는 비브리오 패혈증균의 유전학적 공통 분자가 명확하지 않으며, 해양 환경에서 분리되는 균주와 차이가 크지 않음을 나타낸다고 판단된다.
16S rRNA type에 따른 분류 결과 임상 분리 균주에서 84.0%의 임상형이 확인되었고, 환경 분리 균주에서도 임상형이 70.6%이었다. 패혈증 증상을 일으키는데 중요한 역할을 하는 rtxA 독소 유전자 양성률은 임상 분리 균주(76.0%)와 환경 분리 균주(76.5%)에서 비슷하게 확인되었다. 따라서 해양 환경에서 분리되는 비브리오 패혈증균의 70.6%가 임상형이며, rtxA 독소 유전자 양성률이 76.5%로 높기 때문에 국내 해양 환경에 존재하는 비브리오 패혈증균에 대한 각별한 주의가 필요하겠다. 비브리오 패혈증균은 매우 다양한 유전적 배경을 가지고 있어 여러 가지 방법의 유전적 분석 및 분류가 연구되고 있지만, 뚜렷한 인자를 도출하지 못하고 있다. 따라서 앞으로도 임상과 해양 환경에서 주기적으로 비브리오 패혈증균을 모니터링하고 균주를 확보하여 다양한 분자역학적인 분석을 지속하는 모니터링이 필요하다고 판단된다.



참고문헌

1. Colwell R. R., Kaper J., Joseph S. W. Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and other vibrios: occurrence and distribution in Chesapeake Bay. Science. 1977;198:374-396
2. Blake PA, Merson MH, Weaver RE, Hollis DG, Heublein PC, Disease caused by a marine Vibrio. The N Engl J Med. 1979;300:1-5.
3. Oliver JD: vibrio vulnificus. 570-62. Jn Doyle MP, ed. Food-borne bacterial pathogens. NewYork, Marcel Dekker, 1989.
4. Frank C, Littman M, Alpers K, Hallauer J. Vibrio vulnificus wound infections after contact with the Baltic Sea, Germany. Euro Surveill. 2006;11(7):194
5. 나혜영, 홍사현, 정경태. 2013-2015년 국내 해양환경 분리 병원성 비브리오균의 분포와 환경인자와의 연관성 분석. 주간 건강과 질병. 2016;9(9):154-158.
6. Nilsson WB, Paranjype RN, DePaola A, Strom MS. Sequence polymorphism of the 16S rRNA gene of Vibrio vulnificus is a possible indicator of strain virulence. J Clin Microbiol. 2003;41:442-446.
7. Panicker G, Vickery MCL, Bej AK. Multiplex PCR detection of clinical and environmental strains of Vibrio vulnificus in shellfish. Can J Microbiol. 2004;50:911-922.
8. Han F, Pu S, Hou A, Ge B. Characterization of clinical and environmental types of Vibrio vulnificus isolates from Louisiana oysters. Foodborne Pathog Dis. 2009;6:1251-8. doi: 10.1089/fpd.2009.0343.
9. A Review of Important Virulence Factors of Vibrio vulnificus Current Research. Journal of Biological Sciences. 2014;6(2):76-88.
10. 질병관리본부, 수인성식품매개질환 실험실 진단 실무 지침, 2017.