Abstract

Construction of luminescence and fluorescence tagged Burkholderia pseudomallei for pathogen tracking in a mouse model

Shin Yong-woo, Park Deok-bum, Choi Myung-min, Chun Jeong-hoon, Rhie Gi-eun
Division of High-risk Pathogens, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC
Seong Baik-lin
Department of Biotechnology, College of Life Science and Biotechnology, Yonsei University

Molecular imaging of pathogens causing infectious diseases, at both cell and whole organism levels, is crucial to studying the pathogenesis mechanisms of infectious diseases. In this study, we have produced a luminescence and fluorescence dual-labeled form of Burkholderia pseudomallei, a high-risk pathogen, which can be used to study pathogenesis and the immune responses at live organism, isolated organ, tissue and cell levels simultaneously. Using this method, we could trace B. pseudomallei in mice, and visualize bacterial replication in cells. The method is highly applicable to other pathogens, and could be an extremely useful tool to study the pathogenesis and host immune responses of a variety of infectious diseases.

Keywords: Burkholderia pseudomallei, Molecular imaging, Luminescence, Fluorescence


들어가는 말

최근 세포의 특정 인자 위치를 영상화하는 기술과 함께 살아있는 개체 내에서 특정 인자의 위치를 실시간으로 시각화하여 위치정보를 확인하는 분자영상 기술이 급속도로 발전하고 있다. 생체분자영상 기법은 다양한 분야에서 적극적으로 활용되고 있지만, 감염병 분야, 특히 고위험병원체 연구 분야에 있어서의 적용은 아직 미흡한 실정이다. 병원체의 분자영상분석은 개체 전체뿐만 아니라 세포 수준에서의 병원체 분포 분석과 감염기작 및 면역반응의 상세한 메커니즘 조사 연구에 이용될 수 있다[1,2]. 현재의 병원체 영상화 기술은 항체를 사용하는 형광인자(fluorescence) 및 발광인자(luminescence) 관련된 시각화를 통하여 동물의 생체 내 병원체를 추적하고 있다[3,4]. 그러나 대다수 고위험병원체의 경우 적절한 항체가 존재하지 않으며[5,6], 또한 일반적으로 형광신호는 생체가 가지고 있는 배경신호(background signal) 및 생체조직의 투과성 등의 단점으로 항체기반의 형광신호를 이용한 면역염색방법은 살아있는 동물이나 세포 내의 병원체 추적 연구에 적용할 수 없다. 이러한 문제로 인해 여러 병원체의 생체 내 기작에 대한 연구는 암과 같은 잘 특징지어지는 질병과 비교하여 어렵다는 것이 입증되었다[7,8]. 병원체의 감염 메커니즘을 정확하게 분석하기 위해서는 생체 내 장기, 조직 및 세포 수준에서 동시에 시공간적으로 분석되어야 한다. 이 연구에서는 생체 내에서 일어나는 병원체 증식현상에 대한 영상화를 목적으로 형광인자와 발광인자 이중표지 유비저균을 개발하여 감염병 연구를 위한 생체분자영상 추적 시스템을 구축하였다.


몸 말

유비저균(Burkholderia pseudomallei)은 그람음성균이며 사람에게 유비저(Melioidosis)라는 감염병을 일으키는 고위험병원체이다[9]. 또한 적은 양으로도 병원성을 일으키기 때문에 생물학적 무기로도 사용될 수 있다[10]. 효과적인 백신과 치료법은 아직 개발되지 않았으며 기초연구를 위한 병원체 분포 및 감염된 숙주의 면역반응에 대한 정보가 필요하다[11,12]. 이 연구에서는 생체 내에서 일어나는 유비저균의 숙주 내 병원체 추적과 단일 세포 영상화를 위한 목적으로 이중 표지 유비저균을 제작하였다. 이 연구에 사용된 유비저균은 국내 발생 유비저 환자로부터 분리되었고[13], 유전자 재조합 기법을 이용하여 형광 및 발광 인자 표지화를 위한 유비저균용 벡터를 제작하였다. 형광 신호를 발현하는 M2GFP 유전자와 세포 내에서 효소-기질 작용에 의해 발광신호를 유도하는 발광인자 유전자군(lux operon)이 포함된 pT7-M2GFP-Lux 벡터를 사용하여 형광 및 발광인자가 발현하는 유비저균(H0901-M2GFP-Lux)을 제조하였다(Figure 1A, Table 1). 유비저균의 형광 및 발광인자 발현이 세균 수가 증가함에 따라 영상 신호가 증가함을 정량적으로 관찰 할 수 있었다(Figure 1B).
이후 제작된 H0901-M2GFP-Lux 균주를 실제 마우스에 감염시켜 생체분자영상 분석을 위한 동물실험을 수행하였다. 이 연구에서 진행된 모든 실험은 질병관리본부 지침에 따라 생물안전 3등급 시설(BL3)에서 수행되었으며, 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 실험기준에 따라 진행되었다. 6주령의 BALB/c 마우스에 1x107 또는 1x108 (CFU/mL)의 H0901-M2GFP-Lux 균주를 정맥 주사한 후, 생체영상분석장비 IVIS Lumina III(PerkinElmer, MA, USA)로 영상신호를 분석하여 감염 유비저균의 생체 내 분포양상을 관찰하였다. 마우스 생체 내에서의 유비저균의 발광인자 발현을 확인하였고(Figure 2A), 발광 신호는 PBS 대조군에 비해 현저하게 증가됨을 확인하였다(Figure 2B).
마우스 장기의 경우, 정맥주사한 후 감염된 장기를 적출하여 병원체가 감염된 장기에서의 발광 신호를 정량화하였다. 감염 6시간 후 비장을 비롯한 타 장기로 병원균이 전파됨을 확인할 수 있었고, 대조군에 비해 폐, 간, 비장에 병원체 분포가 크게 증가하였다. 또한 공초점형광현미경(Confocal microscopy, Olympus FV1000)을 사용하여 마우스 비장 조직 내의 병원체 감염양상을 확인하였다(Figure 3A). 세포 수준에서의 관찰을 위해 마우스 대식세포 J774A.1 세포에 10 MOI로 감염시켰다. 2시간 후 공초점형광현미경을 사용하여 유비저균이 세포질에 위치하는 것을 확인하였다(Figure 3B).


맺는 말

생체분자영상 분석기법을 이용한 감염병연구는 개체수준에서 감염 병원체의 실시간 위치정보를 제공할 수 있다. 이번 연구의 결과는 유비저균 감염 이후의 시간에 따른 생체 내 각 기관별 조직 및 세포 수준에서 시공간적 정보를 영상화할 수 있음을 나타낸다. 기존의 일반적인 동물실험 기법은 시간별, 위치별로 분석결과를 얻기 위해 많은 개체의 소모가 필요하지만 이 연구를 통해 확립된 이중표지 영상균주 기법은 한 개체에서 반복적인 관찰이 가능하고 실험에 사용되는 개체 수를 최소화할 수 있어 동물 윤리적 측면에서도 바람직한 방법이라 할 수 있다. 또한 이중 표지 균주를 이용한 영상분석은 숙주의 감염과정을 연구하는 효율적인 방법을 제공할 수 있다. 병원균 특이적 항체 없이도 살아있는 숙주 장기 조직 및 세포에서 동시에 추적할 수 있어 병원체 감염 현상에 대한 자세한 정보 제시가 가능하다. 이중 표지를 이용한 이번 연구의 분석 연구에 응용은 유비저균에 국한되지 않고 다른 병원균으로 확대될 수 있다. 특정 병원체 내에서 복제가 가능한 벡터 및 활성화 프로모터의 교체를 통해 다른 고위험병원체에 적용하여 시각화하고 추적할 수 있다. 또한 영상신호의 높은 발현 양으로 낮은 농도의 병원균 검출 및 분석에도 활용 될 수 있다. 이 연구결과는 생체분자영상 분석을 통한 고위험병원체의 감염양상 연구에 활용이 가능할 것으로 기대된다.


참고문헌

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13. Shin YW, Cho MH, Chun JH, Kim CM, Oh HB, Rhie GE, Yoo, CK. The Laboratory Diagnosis of Melioidosis in a Korean Patient. J Bacteriol Virol. 2011;41:19-25.