I. 들어가는 말

결핵(Tuberculosis, TB)은 지금까지 많은 항결핵제의 개발 및 진단법의 개선, 신속 진단법의 적용, 초국가적인 대응에도 불구하고 여전히 퇴치되지 않고 전 세계 공공보건의 큰 문제와 위협이 되고 있다[1]. 우리나라는 2000년 이후 매년 3만 명 이상의 결핵 신환자와 2천여 명의 사망자가 꾸준히 발생하고 있을 뿐 만 아니라, 주요 항결핵제인 이소니아지드(isoniazid, INH) 및 리팜핀(rifampin, rifampicin, RIF)에 동시 내성을 보이는 다제내성 결핵(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)의 출현으로 치료 실패율이 증가하여 결핵 퇴치 목표달성에 어려움을 겪고 있다.
결핵의 완치를 위해서는 치료기간이 최소 6개월 이상 소요되며, MDR-TB 환자의 경우 2년 이상의 긴 치료기간이 필요하다. 결핵 초치료의 표준처방은 INH, RIF과 함께 에탐부톨(ethambutol, EMB) 그리고 피라진아미드(pyrazinamide, PZA) 등 4가지 약제를 병합하여 2개월간 치료한 뒤, 이후 4개월 동안 INH, RIF 또는 INH, RIF, EMB로 치료하는 2HRZE/4HR(E) 방법을 사용하고 있다[2].
초치료 약제 중 PZA는 초기 염증성 병변과 건락성 괴사 부위와 같이 산성 조건 하에 존재하는 결핵균에 대한 사멸효과가 뛰어나 결핵의 초기 치료에 적극 권고되며, 치료 기간을 단축시키는데 중요한 약제로 사용된다. 그러나 간독성과 관절염, 고요산혈증 등의 부작용을 유발하며, 특히 관절염은 PZA 처방 환자의 약 40%에서 발생한다. 따라서 이러한 부작용으로 인해 일반적으로 결핵 치료 초기에 2개월만 처방하고 있다[2].
PZA는 결핵균이 발현하는 피라진아미다제(pyrazinamidase, PZase)에 의해 피라지노익산(pyrazinoic acid, POA)으로 변환되어 결핵균 사멸의 활성을 보이며, 산소 분압이 낮고 산도(pH)가 낮은 환경에서 활성이 증가한다[3]. 이러한 특성으로 잠복 상태에 있는 결핵균에 효과가 있어, RIF와 함께 잠복 결핵의 치료에 사용된다. PZA를 처방하지 않을 경우 치료기간이 최소 9개월 이상으로 증가하기 때문에[2] 초기 치료에 PZA에 대한 감수성의 신속한 확인 여부가 매우 중요하다.
현재까지 국내에서 PZA에 대한 감수성 확인은 저비용으로 수행할 수 있으며 PZase 활성을 측정하는 Wayne 법을 주로 사용하였다. 그러나 Wayne법은 결핵균을 다량 배양한 후 수행하므로 검사 결과를 확보하는데 시간이 오래 소요되기 때문에 PZA 치료 종료시점에 PZA에 대한 감수성 결과가 도출되는 모순이 발생한다. 따라서 가능한 빠른 시간 안에 PZA에 대한 내성 여부를 판단하기 위한 여러 가지 약제 감수성 검사법과 분자 유전학적 시도가 이루어졌으며 이에 대한 현황을 비교해 보고자 한다.



II. 몸 말

일반적인 항결핵제 검사는 로벤스타인-젠센(Lowenstein-Jensen) 배지 또는 middlebrook 7H10/7H11(BD) 배지 등의 고체배지를 기본으로 한 방법이 전통적으로 사용되었다. 그러나 일차 항결핵제인 PZA의 감수성 검사를 위해서는 특이적으로 배지 환경이 산성조건(pH 5.5 - 6.0)으로 유지되어야 하므로[3] 이를 위한 별도의 검사법이 개발되었다. 현재 항결핵제 PZA를 포함한 고체배지의 배양 검사법은 결과값의 오류가 심해 미국 임상시험 표준협회(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)에서 추천하고 있지 않으며[4], PZase 활성을 간접적으로 측정하는 검사법과 액체배지를 기반으로 한 다양한 감수성 검사법의 개발이 시도되었다.
PZase 활성 검사법은 PZase 활성의 유무와 PZA 내성 사이에 밀접한 인과관계가 존재하는 것을 기초로 한 검사법이다[3]. PZase를 암호화하고 있는 pncA 유전자의 돌연변이로 인해 PZase가 생산되지 않거나 활성이 없어지는 경우에 PZA에 대한 내성을 나타내므로, PZase의 효소 활성을 측정하는 것은 간접적으로 PZA 내성을 측정하는 방법으로 전통적으로 많이 이용되었다.
대표적으로 세 가지 형태의 PZase 검사법이 있다[3]. 첫 번째는 Wayne법으로 POA의 검출을 기본으로 하며, 배양된 결핵균에 1% 황산철 암모늄 ferrous ammonium sulfate 용액을 첨가하였을 때, 결핵균의 PZase 활성에 의해 PZA가 POA로 가수분해되는 것을 이용한다. Ferrous ammonium sulfate와 POA의 반응 결과 연한 갈색 또는 분홍색 띠가 형성되면 감수성으로 판정하고, 색변화가 없으면 PZase 활성이 없는 것으로 판독하여 PZA에 내성으로 판단한다. 러셀법Russell method은 PZA가 POA로 가수분해 되면서 생성되는 암모니아를 검출하며, 페놀-차아염소산염phenol-hypochlorite과 반응하여 푸른색의 화합물을 형성한다. 마지막 맥클랫치법McClatchy method은 박층 크로마토그래피 플레이트에서 특정 유기용매에 의한 PZA와 POA의 서로 다른 이동성을 기반으로 한다. 이와 유사하게 고속액체 크로마토그래피 역시 PZA와 POA의 다른 이동성을 기반으로 하여 PZA 감수성을 측정한다.
PZase 활성을 측정하는 것이 PZA 내성 판독의 좋은 지표로 작용하기는 하지만 그 결과가 항상 PZA에 대한 감수성을 나타내지는 않으며, 육안으로 판독하는 문제점과 낮은 민감도로 인해 위양성을 유발할 수 있는 단점이 있다. 또한 PZase 활성 검사법은 방법의 특성상 결핵균이 다량 필요하므로 배양하는 기간과 검사하는 기간이 배양 양성 판정 후 평균 1-2주 이상 추가로 소요된다. 그러나 검사 단가가 액체 배지를 이용한 방법이나 분자유전학적 방법에 비해 상대적으로 낮아 주로 저소득 국가에서 이용하기에 편한 장점이 있다.
액체 배지 검사법은 PZA에 의한 결핵균 사멸 효과를 측정하기 위해 낮은 pH를 유지하는 배지의 필요성으로 인해 개발되었다. 초기에는 BACTEC 460 system(BD)을 이용하여 표준균주 및 검사대상 균주의 성장 지표(growth index, GI)의 비율을 통해 결과를 산출하는 방사선 동위원소 측정법을 사용하였다[3,5]. 이 방법은 성장 지표 비율(GI ratio)이 9% 이하이면 감수성, 9-11% 사이면 경계 구간, 11% 초과면 내성으로 판독한다. 그러나 결과가 경계 구간일 경우 재검사를 실시해야 하며 방사선 동위원소를 사용했기 때문에 실험자의 안전과 편의를 위해 방사선 동위원소를 사용하지 않고 경계 구간이 제외된 새로운 검사 방법이 요구되었다.
동위원소를 사용하지 않는 검사법으로 BacT/ALERT 3D system(BioMerieux)과 ESP Culture System II(Trek Diagnostic Systems), MB/BACT system(Organon Teknika), 그리고 Mycobacteria Growth Indicator Tube(MGIT) 960 system을 이용한 PZA 감수성 검사법이 개발되었다[3,6]. 위 검사법들은 PZA의 최종농도를 100 ㎍/㎖로 맞추어 McFarland 0.5 농도의 균액을 500 ㎕ 첨가하여 4-21일 동안 배양하여 감수성 여부를 결정한다. 검사할 균주를 100배 희석한 1% proportional control을 제조하여 대조군으로 사용해 검사 대상 균주와 동시에 배양하여 항결핵제가 첨가된 배지에서의 성장 여부와 비교하여 판독한다. 액체 배지를 이용한 방법은 효소 활성 측정법에 비해 간편하고 비교적 빠르긴 하지만, PZA 감수성을 확인하기 위해서는 배양된 균을 새로운 튜브로 옮기거나 희석하는 과정이 필요하며, 양성 판독 후 1주일 이상 소요된다. 그리고 효소 활성 측정법이나 유전자 검사법에 비해 위양성의 결과가 다수 보고되는 등 논란이 있다. 또한 전용 배양 장비 및 전용 튜브를 사용해야 하는 특징으로 인하여 고가의 장비와 소모품 비용이 필요해 주로 검사 건수가 적거나 검사 비용을 부담할 수 있는 선진국 등에서 추천되고 있다.
PZA에 내성을 갖는 균주의 97% 이상에서 pncA의 돌연변이가 나타나기 때문에[3] 신속한 PZA 내성 검출을 위한 여러 가지 분자유전학적 검사법이 개발되었다. 이러한 방법은 PZase 활성 측정법과 유사하게 산성 조건에 의한 결핵균의 성장 억제 문제를 피할 수 있는 장점이 있다. 그러나 이 검사법의 가장 큰 난제는 pncA 유전자 558 bp(GeneBank accession number U59967) 전체뿐만 아니라 pncA 유전자의 -11 bp, -71 bp 부위에서 다양하고 산발적으로 돌연변이가 일어난다는 것이다. 최근에는 POA가 결합하는 것으로 알려진 리보솜 단백질(ribosomal protein) S1 유전자의 변이도 빈도는 적으나 PZA의 내성과 연관되어 있음이 확인되었다.
지금까지 가장 정확한 pncA 돌연변이 확인법은 유전자 증폭반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 염기서열분석(sequencing) 방법이다[7,8]. 그러나 염기서열분석법은 고가의 분석 장비가 필요하거나 내성과 관련된 데이터베이스의 구축이 선행되어야하는 문제점이 있기 때문에 이를 대체하여 일반 실험실 수준에서도 손쉽게 할 수 있고 저비용으로 수행할 수 있는 방법의 개발이 요구되었다. PCR 단일가닥 구조다형성 single-strand conformational polymorphism 방법은 PCR sequencing 방법과 함께 초기 내성 진단 연구에 많이 적용되었다[3,7]. 그러나 여러 가지 primer 세트가 필요할 뿐만 아니라 많은 검체를 동시에 수행하기가 어렵고, 낮은 민감도로 인하여 모든 돌연변이를 검출하는 데 충분치 않기 때문에 PZA 내성을 검출하기 위한 방법으로 사용될 수 없었다. Branch migration inhibition(BMI)법은 유전자 변이가 없는 대조군의 pncA 유전자와 검체의 pncA 유전자를 각각 비오틴(biotin)과 디곡시제닌(digoxigenin)이 결합된 특정 프라이머primer를 이용하여 증폭한 뒤, PCR 산물을 혼합하여 변성 후 재결합 시켜 십자형의 산물을 생성한다. 변이가 존재하는 경우 안정하게 유지되고 변이가 없는 경우 불안정한 산물이 소멸되는 특성을 이용해 변이가 있는 경우 발색반응을 측정하여 내성여부를 판별한다. 발광산소채널 면역분석법 Luminescence oxygen channeling immunoassay 을 BMI와 결합하여 비특이적인 유전자 결합으로 인한 위양성 결과를 감소시킬 수 있었으나 여전히 민감도의 문제가 남아있었다. Line probe assay(LiPA)방법은 총 48개의 탐침(probe)으로 구성된 스트립에 유전자를 결합시킨 후 발색반응을 통해 변이의 존재여부를 판단하는 방법이다[9]. 발색반응의 결과를 통해 여러 부위의 변이가 존재하는 것도 확인할 수 있는 장점이 있다. 그러나 민감도를 높이기 위해 이중 PCR (nested PCR)을 수행하기 때문에 PCR 수행 오류에 의한 위양성의 가능성이 존재한다. 최근에는 LiPA를 이용한 kit을 제조하여 다수 기관에서 배양검체와 객담 도말 양성 검체를 이용한 평가 결과 우수한 민감도와 특이도를 나타내었다[9].
검사의 자동화와 다수 검체를 동시에 수행하기 위해 마이크로칩(microchip)을 이용한 마이크로어레이(microarray) 방법이 개발되었다. 14-20개의 뉴클레오티드(nucleotide)로 구성된 79개의 올리고뉴클레오티드 탐침(oligonucleotide probe)들이 부착된 유리 마이크로칩(glass microchip)에 결핵균 pncA 유전자를 증폭하여 결합시키는 방법으로 내성여부를 판정한다. 방법이 단순하고 시간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 민감도와 특이도가 좋은 장점이 있으나 고가의 장비와 검사 재료비가 요구되어 일반 실험실에서 적용하는데 문제가 있다.
PCR 기반 피라진아미다제 합성법(PCR-based in vitro synthesized pyrazinamidase method)은 PZA 감수성 검사를 일반 실험실 수준에서도 단시간에 수행하기 위해 개발되었다[10]. 임상분리 결핵균으로부터 pncA 유전자의 5' 끝에 T7 프로모터 서열(promoter sequence)이 포함되어 있는 정방향 프라이머(forward primer)를 이용해 PCR을 수행한 후, 전사-번역 (in vitro trancription-translation) 과정에 의해 PZase를 생산한 후 발색반응을 통해 간접적으로 효소 활성을 측정한다. 위 방법은 빠르고 간편하며 고가의 장비가 필요하지 않고 육안으로 쉽게 내성 여부를 판독할 수 있는 장점이 있다[10]. 그러나 객담 검체를 직접 이용할 경우 DNA 추출 과정을 안정화시키는 문제와 여러 기관에서의 평가가 추가적으로 수반되어야 할 필요가 있다.



III. 맺는 말

항결핵제 감수성 검사는 배양된 결핵균을 다루기 때문에 실험실 진단 과정 중 검사자에게 가장 위험한 과정이며, 생물안전 3등급 실험실에서 실시하는 것을 권고하고 있다[4]. 또한 신속하고 적절한 항결핵제의 처방으로 결핵 환자의 치료 효과를 높이고, 활동성 결핵 환자에 의한 접촉자 감염을 최소화하기 위하여 빠르고 정확한 항결핵제 감수성 검사가 요구되고 있다.
특히 일차 항결핵제는 결핵의 초기 치료에 매우 중요하기 때문에 이에 대한 신속하고 정확한 감수성 검사가 필수적이다. 지금까지는 주로 배양검사가 항결핵제 감수성 검사의 기본이었으나, 내성 관련 유전자의 특성 분석과 내성기전 연구의 활성화로 인해 PCR을 기반으로 하는 분자유전학적 내성 확인이 보편화되고 있다.
그러나 단기 화학요법(short-course chemotherapy)을 가능하게 한 PZA의 중요성에도 불구하고, 내성 기전에 대한 이해가 부족하였다. PZA는 반휴지기(semi-dormant) 또는 성장억제균에 좀 더 효과적인 사멸능이 있어 활동성 결핵 환자의 초기 치료에 적극 권장되나, 간독성 등의 부작용으로 인해 주로 2개월만 처방된다[2,3]. 또한 MDR-TB의 50% 내외에서 PZA 동시 내성을 보이기 때문에 PZA 내성 환자의 치료에 주의를 기울일 필요가 있다. 반면 선천적으로 pncA 유전자에 돌연변이가 있어 PZA에 내성을 보이는 Mycobacterium bovis와 PZA 단독 내성 균주를 구분할 필요가 있다[3].
전통적인 PZA 감수성 검사의 문제점은 크게 두 가지이다. 첫 째는 PZA의 활성을 위해 필요한 배지의 산성화가 결핵균의 성장도 억제하는 것으로 pH 5.5의 배지에서 임상균주의 약 20-50%가 배양되지 못한다. 두 번째는 너무 많은 균(107 bacilli/ml 이상)을 사용하면 암모니아의 과분비로 인해 pH가 증가하고 PZA의 불활성화가 유도된다는 것이다. 따라서 이러한 문제점을 극복하기 위해서는 pH에 영향이 없는 PZase 효소 활성을 측정하는 Wayne 법이 권고되지만, 검사 시간의 단축이 PZA 치료 결정에 매우 중요하므로 이를 위한 새로운 진단법의 평가가 이루어져야 한다.
미국 임상시험 표준협회는 BACTEC 460TB PZA test medium(BD diagnostics systems, Sparks, MD)을 PZA 감수성 검사의 표준 검사법으로 추천하고 있으나 현재는 제품의 생산이 중단되어 MGIT system 등 다른 방법으로 대체되고 있다. 그러나 높은 비율의 위양성 결과와 검사 기간의 지연, 고비용으로 인해 새로운 신속 진단법이 요구되고 있으며 신속하고 정확한 분자유전학적 진단법이 다양하게 시도되고 있다.
우리나라의 경우 현재 대부분의 기관에서 Wayne 검사법을 활용하고 있으나, 이 검사법의 가장 큰 문제점은 검사결과를 확인하는데 시간이 오래 걸리는 것이다. 객담이 의뢰된 후 최소 4-6주 이상 후에 내성결과를 확보할 수 있으며, 민감도와 특이도 측면에서 현재 개발된 분자유전학적 진단법에 비해 우수하지 못한 결과를 보인다[7]. 분자유전학적 진단법이 더 많은 검체를 가지고 여러 기관에서의 평가가 필요하나 현재까지의 결과로는 Wayne법(민감도 89%)보다 분자유전학적 진단법(민감도 96%)의 민감도가 우수하며 특이도는 서로 유사하게 나타났다 (Table 1)[7]. 따라서 PZA 감수성 검사를 위한 분자유전학적 진단법의 도입은 검사자의 안전을 확보하고 신속하고 정확한 내성 정보의 확인을 통하여 환자 치료에 도움을 주기 위해 적극적인 검토가 필요하다.



IV. 참고문헌

1. WHO. Global Tuberculosis Control WHO Report, 2011
2. 결핵진료지침. 2011
3. Zhang Y, Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review. Int J Tuberc Lung Dis 2003;7:6-21
4. CLSI. Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved standard second edition. CLSI document M24-A2. 2011
5. Davies AP, Billington OJ, Mchugh TD, Mitchison DA, Gillespie SH. Comparison of phenotypic and genotypic methods for pyrazinamide susceptibility testing with Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2000;38:3686-3688
6. Aragon LM, Garrigo M, Moreno C, Espanol M, Coll P. Evaluation of the BacT/ALERT PZA kit in comparison with the BACTEC 460TB PZA for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to pyrazinamide. J Antimicrob Chemother. 2007;60:655-657
7. Chang KC, Yew WW, Zhang Y. Pyrazinamide susceptibility testing in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review with meta-analyses. Antimicrob. Agents Chemother. 2011;55:4499-4505.
8. Suzuki Y, Suzuki A, Tamaru A, Katsukawa C, Oda H. Rapid detection of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis by a PCR-based in vitro system. J Clin Microbiol. 2002;40:501-507
9. Mitarai S, Kato S, Ogata H, Aono A, Chikamatsu K, Mizuno K, et al. Comprehensive multicenter evaluation of a new line probe assay kit for identification of Mycobacterium species and detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2012;50:884-890.
10. Zhou M, Geng X, Chen J, Wang X, Wang D, et al. Rapid colorimetric testing for pyrazinamide susceptibility of M. tuberculosis by a PCR-based In-vitro synthesized pyrazinamidase method. PLoS ONE. 2011;6:e27654.