Ⅰ. 들어가는 말

병원체 등 생물시료의 형태를 관찰하기 위해서는 일반적으로 현미경이 사용된다. 광학현미경(light microscopy, LM)은 가시광선을 광원으로 활용하여 비교적 쉽게 생물시료를 관찰할 수 있지만 마이크로미터단위(10-6m)의 낮은 분해능으로 인해 미세시료를 관찰할 수 없는 제한점이 있다. 광학현미경의 단점인 낮은 분해능을 보완하기 위해 가시광선 대신 전자선을 광원으로 활용하는 전자현미경(electron microscopy, EM)이 개발되었으며 광학현미경보다 고배율, 고해상도의 시료를 관찰할 수 있게 되었다. 이러한 높은 분해능의 전자현미경을 사용하여 나노미터단위(10-9m)의 세균이나 바이러스 등 미세시료를 관찰할 수 있게 되었고 활용 범위도 넓어졌다[1].
전자현미경의 종류에는 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM)과 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)이 있다. 일반적으로 주사전자현미경은 시료의 표면을 관찰하게 되고, 투과전자현미경은 시료를 투과하여 내부 구조를 관찰한다. 적용분야로는 생물시료, 금속, 고분자, 반도체 등의 형태, 미세구조, 구성 원소의 분포 등을 분석하는 영역에서 전자현미경이 폭 넓게 사용되고 있다[2].
눈으로 볼 수 없는 각종 질병의 원인이 되는 다양한 병원체에 대한 확인 및 연구가 전자현미경을 통하여 전 세계적으로 다양하게 이루어지고 있다. 세균, 바이러스, 기생충, 질병매개곤충 등 여러 종류의 병원체를 전자현미경을 이용하여 다양하게 관찰할 수 있으며 국립보건연구원에서는 2012년부터 주사전자현미경을 통해서 형태학적 분석을 실시하고 있다. 일반적으로 세균의 분류는 여러 형태학적 특징을 비롯하여 각종 물질대사에 수반되는 생리학적 여러 가지 특징, 핵산물질 및 염기의 조합비, 면역학적 특징 및 병원성의 유무 등을 기준으로 한다. 이와 더불어 주사전자현미경을 이용하면 세균을 직접 관찰하고 그 정보를 통해 형태학적인 특징과 구조적 차이를 분석할 수 있다. 이러한 정보를 활용한다면 병원체에 대한 연구 분야, 특히 형태학적 특성 연구 분야가 한층 더 다양해 질 수 있다. 또한 미세 형태학적 자료 정보는 감염병 병원체 관련 전문가들의 이해도를 높이고 연구 영역 확대 측면에서도 매우 의미가 있다고 할 수 있다.
이 글에서는 국립보건연구원 Core Lab에서 운영하고 있는 주사전자현미경을 이용하여 병원성 간균 및 구균의 형태학적 특징 비교와 털진드기의 형태학적 특징을 비교한 결과를 기술하고자 한다.




Ⅱ. 몸 말

본 연구는 국립보건연구원 감염병센터 병원체방어연구과 국가병원체자원은행(National Culture Collection for Pathogens, NCCP) 자원정보 관리시스템에 등록된 병원체 중 주요 세균의 외부 형태를 확인하고 병원체 자원의 분양을 원하는 연구자들에게 자원의 기본적인 형태와 배열, 세균의 크기, 구조적 차이 등 정보를 제공하기 위하여 수행되었다. 30속 63종의 세균을 주사전자현미경을 이용하여 간균, 구균, 세포벽, 협막 등 세균의 형태학적 차이를 관찰하였다. 그 중 간균과 구균을 일부 선별하였으며, 그 목록은 Table 1과 같다.


주사전자현미경을 통한 형태학적인 분석을 위해서는 시료의 전처리 과정을 필요로 한다. 구조적 손상 방지와 살아 있는 상태와 같은 형태를 유지하기 위하여 고정, 탈수, 건조 등 매 단계 전처리 과정이 중요하며 다음과 같은 전처리 과정을 수행하였다[3,4].
세균을 배양한 배지에서 소량의 콜로니를 필터에 부착하여 2% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)용액으로 4℃에서 2시간 전고정 처리를 한 후 0.05M 카코딜레이트 완충액(cacodylate buffer, pH 7.2)으로 10분간 3회 세척을 실시하였다. 다음 1% 오스뮴산(osmium tetroxide) 용액으로 4℃에서 2시간 후고정 처리를 하였으며 증류수로 10분간 2회 세척하였다. 이후 에탄올을 단계별(30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 100, 100%)로 각각 10분씩 처리하여 탈수과정을 진행하였으며, 건조과정으로 100% HMDS(hexamethyldisilazane)를 이용하여 1분간 2회 처리한 후 공기 중에서 다시 건조를 실시하였다. 건조가 끝난 시료는 카본테이프(carbon tape)가 부착된 알루미늄 스터브(aluminum stub)에 올려놓고 ION-COATER(COXEM, Korea) 기기를 이용하여 백금으로 코팅을 실시하였으며, 이후 Carl Zeiss EVO LS 10(Germany) 주사전자현미경으로 전자빔의 크기(Spot size)는 10pA, 렌즈와 물체와의 거리(working distance, WD)는 5mm, 가속전압은 15kV로 관찰하였다.



간균은 전체적인 형태가 막대모양 또는 원통형의 세균이다[5]. 관찰한 Aeromonas hydrophila(Figure 1-A), Salmonella typhimurium(Figure 1-B), Shigella sonnei(Figure 1-C)는 모두 간균의 형태로 크기가 약 1.5㎛로 비슷하게 나타났다. 그러나 Shigella속과 Salmonella속의 경우 균의 끝 부분이 둥근 형태를 이루는 반면 Aeromonas속의 경우 끝 부분이 약간 뾰족한 형태를 이루고 있다. 또한 Aeromonas속의 경우 편모의 형태가 관찰이 되었지만(Figure 1-A, arrow) Shigella속과 Salmonella속의 경우 관찰되지는 않았다. 전자현미경을 이용하여 간균을 관찰하면 외형의 미세구조, 편모 및 섬모의 존재 유무, 주름 등의 상세한 구조적 차이를 확인할 수 있다. 그러나 Shigella속과 Salmonella속의 경우 전체적인 구조 및 형태가 비슷하여 본 연구에서 사용된 기본 전처리 과정을 통한 관찰 결과로는 형태학적 차이를 확인할 수 없었다.



구균은 둥근 모양의 세균으로 형태에 따라 따로 존재하는 단구균, 짝을 이루고 있는 쌍구균, 사슬모양으로 연결된 연쇄상구균, 포도상의 형태로 존재하는 포도상구균 등으로 구분이 된다[5]. 이러한 특정 배열을 비교 관찰하기 위하여 Enterococcus faecalis(Figure 2-A), Staphylococcus capitis(Figure 2-B), Streptococcus sanguinis(Figure 2-C), Streptococcus pneumoniae(Figure 2-D)를 각각 전술한 바와 같이 전처리 하여 주사전자현미경으로 관찰 하였다. 4종 모두 구균의 형태를 이루고 있으며 각각 쌍구균, 포도상구균, 연쇄상구균으로 형태에서 차이가 나타났다. Enterococcus속의 경우 단일의 쌍구균 또는 짧은 연쇄형을 이루고 있으며 Staphylococcus속의 경우 포도송이가 뭉쳐있는 포도상의 형태가 잘 나타났다. Streptococcus속의 경우에는 구균들이 사슬모양으로 길게 나열된 형태를 관찰할 수 있었다. 하지만 Streptococcus pneumoniae(Figure 2-D)의 경우 쌍구균이 사슬모양의 형태를 이루고 있을 것으로 예상하였으나, 일정한 배열의 형태가 관찰되지 않았다. 균의 모습도 양쪽으로 늘어난 마름모의 형태와 표면에 돌기가 형성된 모습(inset, arrow)이 관찰되어 앞의 균과 확연히 다른 특징이 나타났다. 이러한 배열의 형태를 관찰하여 각 균이 가지고 있는 특징을 주사전자현미경을 통하여 확인할 수 있다. 또한 특징들을 비교하여 각 균의 형태학적 차이를 확인하고 그 정보를 제공할 수 있다.
세균과 마찬가지로 주사전자현미경을 통한 주요 매개곤충의 미세 형태 관찰은 분류학적으로 매우 중요한 단서를 제공 해 줄 수 있다. 쯔쯔가무시증의 주요 매개체인 털진드기를 대상으로 전자현미경적 미세구조를 관찰하였으며, 그 중 Leptotrombidium pallidum(대잎털진드기)를 사용하였다. 실험방법은 100% 에탄올에 담겨있는 털진드기를 선별하여 건조한 후 바로 백금으로 코팅을 처리하여 주사전자현미경으로 전자빔의 크기(Spot size)는 200pA, 렌즈와 물체와의 거리(working distance, WD)는 15mm, 가속전압은 15kV로 관찰하였다.



대잎털진드기의 복부(Figure 3-A)와 머리 부분(Figure 3-B)을 확대하여 관찰하였다. 전체적인 외형의 모습은 다리와 몸 전체에 털이 형성되어 있으며 다리는 마디로 나누어져 있다. 성충시기에는 4쌍의 다리를 가지나 관찰한 털진드기는 3쌍으로 유충기임을 확인할 수 있었다[6]. 몸 전체에 형성된 털의 경우 새의 깃털처럼 중심으로부터 양쪽으로 잔털이 무수히 나있다. 또한 복부에 밀집하여 형성되어 있고 다리의 끝부분에도 다수 형성된 것을 관찰하였다. 머리 부분을 확대하여 관찰하면 입 주변에 양쪽으로 털이 하나씩 형성되어 있는 것을 확인할 수 있으며(Figure 3-B, arrow) 입의 끝 부분에도 잔털이 형성되어 있다. 머리뿐만이 아니라 순판의 모양, 감각모 등 다른 부위의 미세관찰을 주사전자현미경을 통하여 각 종이 가지고 있는 특징을 확인할 수 있으며 이러한 특징을 비교하여 종의 분류에 대하여 도움을 줄 것으로 생각된다.




Ⅲ. 맺는 말

세균과 털진드기의 형태학적 특성을 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과, 세균이 가지고 있는 구조적 형태와 특징, 배열이 간균과 구균 등 균종에 따라서 다르게 나타났고, 간균과 구균의 미세 형태학적 특징을 구분하여 비교, 확인할 수 있었다. 털진드기의 경우에도 종마다 가지고 있는 특징과 외부 형태를 관찰하여 비교할 수 있었으며 각각의 차이점도 확인이 가능하였다.
보다 높은 배율, 고배율의 관찰을 통해서 세균의 편모와 섬모, 위치와 수, 배열 등의 추가적인 정보도 얻을 수 있다. 세균의 외막 구조와 표면의 구조를 관찰하여 주름이 있거나 굴곡진 형태, 협막 등 구조적 차이에 대한 정보 획득이 가능해 지며, 털진드기도 각 종마다 가지고 있는 특정한 구조를 확인하면 동정에 사용할 수 있다. 다른 병원체도 외부 형태와 각 종마다 가지고 있는 특징적인 구조를 주사전자현미경을 사용하여 관찰하고 비교를 할 수 있으리라 생각된다.
세균의 크기보다 훨씬 작은 바이러스의 구조는 투과전자현미경을 이용하여 추가적인 연구가 가능하며 주사전자현미경의 전처리 과정과는 다르게 Negative staining 방법으로 염색을 처리하게 된다. 향후 투과전자현미경으로 바이러스의 특징적 외형과 구조, 크기 등을 확인함으로써 각 바이러스마다 가지고 있는 구조적 차이를 관찰할 예정이다.
현재 국립보건연구원에서 연구하고 있는 병원체의 형태학적 미세구조를 관찰하고 비교하는데 주사전자현미경의 사용으로 가능해 졌다. 이러한 형태학적 특성과 차이를 관찰하고 그 정보를 이용하여 연구 분야 확대에 도움이 될 것으로 기대가 된다. 주사전자현미경을 통해 형태학적 차이가 뚜렷하게 나타나지 않는 균에 대해서는 향후 투과전자현미경 기술 도입 및 분자생물학적인 연구의 접목을 통하여 비교가 가능할 것으로 생각된다.




Ⅳ. 참고문헌

1. Park CH, Yeom MJ, Uhm CS. History of microscope from the magnifying glass to the field emission electron microscope. Korean J. Electron Microscopy. 2003. 33(2): 93-104.
2. 정석균, 전정범. 주사전자현미경의 기본원리와 응용(Part I). Korean Industrial Chemistry News. 2009. 12(6): 39-46.
3. Kim SR, Rhee MS, Kim MC, Kim KH. Modeling the inactivation of Escherichia coli O157:H7 and generic Escherichia coli by supercritical carbon dioxide. Int J Food Microbiol. 2007. 118(1): 52-61
4. Lee JC, Stewart GC. Essential Nature of the mreC Determinant of Bacillus subtilis. J Bacteriol. 2003. 185(15): 4490-4498.
5. Jackman J. The Microbe: The Basics of Structure, Morphology, and Physiology as They Relate to Microbial Characterization and Attribution. Chemical and Physical Signatures for Microbial Forensics, Infectious Disease. Springer, New York. 2012. 13-34.
6. 질병관리본부. 쯔쯔가무시증 매개 털진드기의 특성 및 분포. 주간 건강과 질병. 2012. 9: 234-238.