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질환연관 유전자변이 기능 연구 동향
  • 작성일2013-03-08
  • 최종수정일2013-03-15
  • 담당부서질병관리본부
  • 연락처043-719-7179

질환연관 유전자변이 기능 연구 동향
Trends in Functional Study of Disease-associated Genetic Variants

국립보건연구원 유전체센터 형질연구과

김정민


Ⅰ. 들어가는 말


  유전자변이(genetic variation)는 인구집단 내에서 또는 인구집단 사이에서 나타나는 대립유전자 차이를 의미하고, 생명정보를 담고 있는 DNA 염기배열의 변화 또는 차이를 나타낸다. 이러한 유전자변이의 종류에는 SNP (Single Nucleotide Polymorphism, 단일염기다형성)와 SV (Structural Variation, 구조변이) 등이 있다. 최근 연구결과를 통해 이러한 유전자 변이들이 표현형(phenotype)의 변화, 질병에 대한 민감성, 그리고 치료 약제에 대한 반응의 차이 등 개인 간의 차이를 결정짓는다고 알려졌으며, 특히 질환 발생과 진행과정에 관여하는 변이들을 질환연관 유전자변이(Disease-associated Genetic Variants)라고 칭한다.

  1953년 왓슨(Watson)과 크릭 (Crick)에 의해 DNA 분자구조가 밝혀지고, 1977년에 생거(Sanger)와 맥삼-길버트 (Maxam-Gilbert)에 의한 DNA 시퀀싱(Sequencing, 염기서열해독법) 이 개발됨으로써 본격적인 유전자변이에 대한 연구가 진행되었다. 또한 1983년에 염기서열해독에 필요한 DNA의 특정한 지역을 무제한 복제할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction) 기술의 개발로 질환연관 유전자변이 발굴이 더욱더 활발해졌다. 더불어, 1990년 인간유전자 전체의 염기서열을 해독하기 위한 Human Genome Project가 시작되어 2003년에 최종본이 만들어진 이후 질환연관 유전자변이를 탐색하는 연구가 본격적으로 시작되었다(Figure 1) [1]. 이와 함께 어레이(Array) 기술과 시퀀싱 기술의 비약적인 발전으로 지난 수년간 전장유전체연관성분석(GWAS: Genome-Wide Association Study)을 통해 인간유전체 전장에 걸쳐 다양한 질환과의 연관성을 나타내는 유전자변이들(SNPs, SVs)이 기하급수적으로 발굴되고 있다(Figure 2) [2]. 또한 최근에는 차세대 염기서열 해독법(NGS, Next Generation Sequencing)을 사용하여 더 많은 질환연관 유전자변이가 빠르고 정확하게 발굴 및 보고되고 있다[3].

  이와 같이 질환연관 유전자변이는 최신 유전자분석 기술과 생물통계학의 도움으로 대량으로 발굴되고 있다. 하지만, 발굴된 유전자변이에 대한 질환연관 기능연구 결과는 많이 보고되고 있지 않는 현실이다. 2012년 말 기준으로 GWAS 연구로부터 발굴된 제2형 당뇨병(T2D, Type 2 Diabetes) 관련 유전자변이 개수는 대략 80개 정도인 반면에 질환관련성 기능검증까지 완료된 경우는 거의 없다(Figure 3) [4].
따라서 질환연관 유전자변이의 기능연구에 대한 인적, 재정적 투자와 더불어 체계적인 접근방법이 필요하다고 주장되고 있다 [5]. 이러한 추세에 맞춰 형질연구과에서는 지난 6년간 지역사회코호트와 정상인군/환자군 으로부터 대규모 전장유전체연관분석연구(GWAS)를 수행하여 한국인 복합질환 관련 유전자변이를 발굴하였고, 이들에 대한 질환연관 기능연구를 수행중이다[6-8].
이 글에서는 질환연관 유전자변이에 대한 기능연구 최신동향 및 연구방법과 함께 국립보건연구원 형질연구과에서 수행한 연구 진행과정을 소개하고자 한다.


Ⅱ. 몸 말


1. 질환연관 유전자변이 기능연구 동향 및 연구방법

  오늘날 질환연관 유전자변이의 발굴은 최신의 NGS 기술발전과 인간질환에 대한 관심 및 투자의 증가로 엄청난 속도로 진행되고 있다. 그리하여 몇 년 전 까지는 개인유전체 염기서열해독이 특정 소수를 위한 연구로 진행되었지만, 최근에는 다양한 질환과 그룹에 대해 대규모로 진행되고 있다. 2012년 10월, 미국 캔사스시티의 어린이병원에서는 일루미나(Illumina)사 HiSeq2500 (염기서열분석기 모델) 을 이용하여 50시간 만에 신생아의 전체지놈염기서열분석(WGS: Whole Genome Sequencing)을 수행하였다. 이는 초기 진단이 중요시 되는 심각한 신생아 유전질환에 대한 원인유전자변이를 발굴하여 신속하게 치료에 적용한 사례가 된다. 또한 WGS 분석보다는 비용과 시간에서 유리한 전체엑솜시퀀싱(WES: Whole Exome Sequencing) 을 통하여 질병의 원인이 되는 유전자변이를 빠르게 검출하여 질병의 조기진단과 치료에 도움이 되는 연구 사례가 늘어가고 있다[9-11]. 이처럼 지속적으로 질환연관 유전자변이를 발굴하고 생물학적 기능검증을 통하여 질환연관성을 밝히는 일련의 과정은 질환치료와 예방적 측면에서 앞으로 반드시 필요한 분야이다.
  그러나, 현재까지 발굴된 유전자변이에 대한 질환연관 기능연구는 더디게 진행되었는데 첫 번째 이유로는 발굴된 유전자변이들의 대다수가 단백질을 만드는 정보를 가지지 않는 지역(non-coding region)에 위치하고 있기 때문에 이러한 지역에서 유전자변이의 생물학적 의미를 생물정보학적 접근으로 밝히기가 어려웠으며, 유전자변이를 갖는 모델생물을 제작하기도 쉽지 않았다(Table 1). 단백질에 대한 정보를 가지고 있는 영역인 유전자 엑손(Exon)영역에 변이가 발생하는 경우 변이유전자를 세포주나 동물모델에서 인위적으로 과발현(overexpression) 하거나 억제하여(knockdown) 그 결과로 나타나는 생물학적 변화를 연구하면 되지만, 엑손이 아닌 영역, 즉 intron 이나 intergenic 등과 같은 non-coding 지역에 위치한 경우에는 상동성재조합(homologus recombination)에 의해 변이를 도입해야 하는데 성공률이 매우 낮았다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 2011년 전문가들은 유전자변이의 질환관련성을 찾는 기능연구 전략을 다음과 같이 크게 3단계로 제시하였다. 1단계로는 시퀀싱을 통한 변이 확인을 수행하고, 2단계로는 eQTLs (Expression Quantitative Trait Loci)과 같은 생물정보학적 분석과 문헌조사 등을 통하여 유전자변이와 질환연관 유전자 또는 단백질과의 상호관련성을 조사하고, 3단계로는 여러 가지 모델생물을 이용한 다양한 접근방법(knockout of regulatory regions, chromatin association, gene perturbations, miRNA 조사 등)을 통한 질환연관성 검증단계로 진행된다(Box 1). 최근에 급속한 기술발전이 이루어지고 있는 ZFN (zinc finger nuclease), TALEN (TAL Effector Nuclease) 과 같은 engineered nuclease를 이용한 genome editing 기술을 통하여 세포나 배아에 유전자변이를 빠르고 정확하게 도입하여 유전자변이 모델 제작이 가능하게 되었으며 기능연구에 이용할 수 있게 되었다[12, 13]. 질환연관 기능연구가 많이 진행되지 못한 두 번째 이유로는 유전자변이 질환모델로서 많이 이용되는 세포주와 마우스 모델의 한계성 때문이다. 세포주 모델의 경우는 개체수준에서 유전자변이를 연구하는 것이 아니라 개체를 구성하는 수많은 세포종류 중에서 몇 개의 세포에서 수행하므로 연구의 한계성이 존재하고 마우스 모델의 경우는 비용, 인력, 사육기간, 시설 등의 이유 때문에 많은 수의 유전자변이를 연구하기가 쉽지 않은 현실이다[5]. 이러한 문제를 극복하기 위하여 인간과 같이 척추동물이고, 유사유전자를 갖고 있으며, 세대교체 시간도 짧고, 많은 개체 확보가 용이한 제브라피쉬(Zebrafish, 담수어의 일종)를 이용하는 인간질환 연구가 활발히 시작되고 있는 상황이다[14].
  근래에 보고된 질환연관 유전자변이의 기능연구 경향은 주로 유전자변이가 위치하거나 근처에 위치한 유전자의 발현을 인위적으로 증가 또는 감소시켜 나타나는 질환발생 기작을 이해하는 것에 집중되고 있었고[11], 국내의 경우는 시작단계로서 GWAS 연구로부터 발굴한 정신질환 관련 유전자변이에 대해 마우스(생쥐)를 이용하여 기능연구를 수행한 결과가 보고되었다[15]. 질환연관 유전자변이 기능연구에 있어서 최근 추세는 크게 세 가지 방향으로 진행되고 있다. 첫 번째로는 어레이 결과로부터 발굴된 유전자변이에 대해 NGS 기술을 이용하여 정확한 변이 위치 및 염기서열을 검증하고, 그 결과 좀 더 정확한 질환연관 유전자변이를 발굴하는 것이다. 얼마 전에 발표된 1000지놈프로젝트(1000 Genome Project)에서는 14개의 인구집단에서 1,092명의 사람들에 대한 시퀀싱을 수행하여 정확한 인간유전자변이에 대한 결과를 보여주었다[3]. 두 번째로는 발굴된 유전자변이를 가지는 모델생물을 제작하는데 있어서 기존에 많이 사용하던 방법인 유전자 과발현 또는 발현 억제된 모델생물을 제작하여 유전자의 발현 만에 의한 기능연구를 수행하는 접근방법 뿐 아니라, ZFN/TALEN 과 같은 engineered nuclease를 이용한 genome editing 방법으로 유전자변이를 가지는 모델생물을 빠른 시간에 제작하여 유전자변이의 질환관련 생물학적 의미를 찾는 것이다. 세 번째로는 그동안 주로 이용되었던 모델생물인 마우스의 경우에는 연구결과를 얻기까지 오랜 시간이 필요하므로 인간과 같이 척추동물인 제브라피쉬(Zebrafish)를 이용하여 더욱더 빨리 그리고 동시다발적으로 많은 변이 개체를 이용한 기능연구를 수행하는 것이다(Figure 4) [16, 17].

2. 질환연관 유전자변이 기능연구 진행상황

  형질연구과에서는 지난 수년간 지역사회 코호트기반과 정상군/환자군 GWAS 연구로부터 복합질환 관련 후보 유전자변이를 발굴하고 생물정보학적 분석을 수행한 후 질환연관 유전자변이를 선별하고 세포주와 모델생물을 활용하여 질환연관 기능연구를 수행하고 있다.

1) GWAS 결과로부터 질환연관 유전자변이 발굴 및 기능연구를 위한 선별
  전장유전체연관분석을 통하여 한국인 복합질환(제2형 당뇨병, 골 관련 질환, 혈압, 관상동맥질환, 위암, 유방암 등)관련 유전자변이들을 발굴하였고, 생물학적 의미를 부여하고 질환관련 기능연구를 위하여 생물정보학적 분석과 알려진 기능 및 문헌조사를 바탕으로 기능연구를 위한 후보유전자를 선별하였다. 현재까지 제2형 당뇨병 관련 4종, 골 관련 질환 2종, 알콜성 뇌질환 관련 1종, 혈중요소질소(BUN, Blood Urea Nitrate) 관련 1종, 위암/유방암/자궁암 관련 20종, 관상동맥질환 관련 2종 등의 후보유전자들을 선별하였다.

2) 발굴된 유전자변이에 대한 세포주 및 모델생물을 이용한 질환연관 기능연구
  제2형 당뇨병 관련 기능연구에서는 당뇨병과 밀접한 관련이 있는 인슐린 분비 세포를 이용하여 세포내로 siRNA (small interfering RNA)를 도입하여 해당 유전자발현을 억제한 후에 인슐린분비능력을 측정하는 분석법을 수행하였다(Figure 5-A). 골 관련 질환연관 기능실험에서는 발굴된 질환연관 유전자가 조골세포(Osteoblast cell)와 파골세포(Osteoclast cell) 분화에서 NF-kB 와 IL-6 단백질 생성을 조절하여 골 관련 질환 관련성을 보여주었고, 또한 파골세포 분화에 중요한 역할을 하는 ZNF462 전사인자도 발굴하여 파골세포 분화에 밀접한 관련이 있음을 찾았다(Figure 5-B). 위암, 유방암, 자궁암 관련 유전자변이에 대한 연구는 암세포에 siRNA를 도입한 후에 암세포의 성장(proliferation), 전이(metastasis) 관련성을 탐색하여 암과의 연관성을 확인하였다(Figure 5-C). 또한 알콜성 뇌질환 관련 유전자 변이의 경우에는 rat (쥐)에 지속적인 알콜을 투여한 후에 뇌조직을 적출하여 알콜 투여로 인한 후보유전자의 발현감소를 통하여 질환관련성을 알아보았고, 세포주를 이용한 siRNA 실험에서 유전자발현 조절을 통한 알콜 유도 세포사멸 실험을 통하여 질환관련성에 대한 추가적인 결과를 얻었다. 세포주에서의 결과를 바탕으로 후보유전자변이의 질환연관성을 확인한 후에 engineered nuclease 기술을 이용하여 제브라피쉬 모델을 제작하여 유전자변이와 질환과의 관련성을 연구 중이다(Figure 5-D).


Ⅲ. 맺는 말


  지난 수년 동안 발굴된 질환연관 유전자변이들에 대한 생물학적 의미를 찾는 기능연구 필요성이 최근에 요구되었지만, 발굴된 유전자변이들의 위치가 단백질을 코딩하는 영역이 아닌 지역에 대부분 위치하여 연구가 쉽지 않았다. 하지만, 최근에 engineered nuclease를 이용한 genome editing 기술의 급속한 발전과 함께 미지의 영역으로 간주되었던 non-coding 영역에 대한 다양한 유전체 정보의 제공으로 가능하게 되었다. 또한 지난 수년간의 어레이 기술과 현재의 시퀀싱 기술의 발전으로 향후 지속적으로 발굴될 질환연관 유전자변이에 대한 기능연구의 필요성은 앞으로도 계속 증가할 것이다. 이러한 시대적 흐름에 한발 앞서나가고자 국립보건연구원 형질연구과에서는 지난 수년간 지역사회 코호트기반과 정상인군/환자군 전장유전체연관분석결과로부터 복합질환 관련 후보 유전자변이를 발굴하고 최신의 세포생물학, 분자생물학, 생화학적 기술을 이용하여 질환연관 기능검증 연구를 수행중이다. 앞으로 도래할 개인맞춤유전체의학시대에서 확보될 개개인의 유전자변이에 대한 정보를 바탕으로 진행될 개인맞춤 질병치료 분야에서도 유전자변이의 생물학적 의미를 밝히는 기능연구는 꼭 필요하다고 할 수 있다.

Ⅳ. 참고문헌

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3. The 1000 Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.. Nature 491:56-65, 2012.
4. Sanghera DK and Blackett PR. Type 2 Diabetes Genetics: Beyond GWAS, J Diabetes Metab 3:198. doi:10.4172/2155-6156, 1000198, 2012.
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8. Cho et al., Meta-analysis of genome-wide association studies identifies eight new loci for type 2 diabetes in east Asians. Nature Genetics, 44(1):67-72, 2012.
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10. 엑솜시퀀싱 (Exome Sequencing)으로 중증 지적 장애 진단. 게놈연구재단 게놈타임즈, 11월호, 2012.
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17. Bedell et al., In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature, 491:114-118, 2012.

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