개정된 시험법에 의한 국내 칸디다 분리주의 항진균제 감수성 시험 분석
Analysis of antifungal susceptibility testing of Candida isolates by revised CLSI and EUCAST method

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 약제내성과
유재일

Ⅰ. 들어가는 말

  최근 30년간 전 세계적으로 칸디다혈증을 비롯한 진균 감염의 빈도가 꾸준히 증가하였고 이에 따라 항진균제 사용이 급증하여 항진균제에 대한 내성 획득 균에 대한 보고와 관심이 높아지고 있다. 국내의 경우 2006년 국내 10개 병원의 다양한 임상검체에서 분리된 1,301주의 칸디다 종(Candida spp.)을 대상으로 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)법으로 항진균제 내성 검사를 실시한 결과 각 병원에서 분리된 칸디다 종의 플루코나졸 비감수성(non-susceptible) 균주의 비율이 각 병원에서 사용한 플루코나졸 사용량과 연관성이 있음이 입증된 바 있다[1].

  또한 국내 5개 대학병원에서 암포테리신 B와 플루코나졸 항진균제에 동시에 고도내성을 보인 세계적으로 매우 희귀한 균종인 Candida haemulonii 균종이 발견되었고, 이들은 각 환자에서 대부분 이전의 항진균제 사용과 연관되어 있고 항진균제의 치료실패와 연관되어 있음이 보고되었다[2, 3]. 최근 국내에 암포테리신 B, 플루코나졸 이외에도 에치노칸딘 항진균제 등 다양한 항진균제 사용량이 증가하고 있다. 
 
  유럽에서는 European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing(EUCAST) 항진균제 감수성 시험을 정립하고 임상적 치료결과와 연관되는 연구가 활발히 진행되고 있는데, CLSI법과 다소 차이를 나타냈으나[4-6], 2011년 CLSI와 EUCAST법의 조율이 이루어지면서 항진균제 감수성 시험의 표준법으로 알려진 CLSI법의 내성 판정 기준이 개정되었고, 임상균주에 대해 CLSI 및 EUCAST법을 이용한 감수성 결과의 비교연구가 활발히 시행되고 있다[7, 8].

  본 연구에서는 국내 12개 병원에서 분리된 효모 중 칸디다 종에 대한 항진균제 감수성 시험을 개정된 미국의 CLSI 시험법과 유럽의 EUCAST법을 사용하여 실시하고 그 결과를 비교 분석하였다.


Ⅱ. 몸 말


  2011년 1월부터 12월까지 12개월간 국내 10개 병원의 혈액배양에서 분리된 칸디다 종과 2012년 3월부터 5월까지 3개월간 국내 12개 병원에서 무균 체액(복막액, 뇌척수액, 늑막액), 창상, 조직, 농(ear discharge 등), 소변, 중심정맥 카데터 등 각종 임상검체에서 분리되어 동정검사가 시행된 주요 효모 중 분리 동정된 칸디다 종을 대상으로 항진균제 감수성 시험을 실시하였다. 이때 혈액배양은 해당 병원에서 사용하는 자동화 혈액배양 시스템인 BACTEC 9240 system(Becton Dickinson, USA) 혹은 BacT/Alert system (bioMérieux, Durham, NC, USA) 등을 이용하였다.

  칸디다 종의 동정은 형태학적, 생리학적 및 생화학적 검사를 조합하여 시행하였다. 칸디다 종의 동정에는 주로 발아관 형성 시험, API 20C(bioMérieux, France)와 Vitek 2 yeast card(YST), bioMérieux France) 검사 성적 및 cornmeal agar와 CHROMagar Candida(Gemini, UK)에서 48시간 배양 후 형태관찰 등을 이용하였으며, 필요한 경우 염기서열분석을 실시하여 동정하였다. 즉 5.8S rRNA를 포함한 internal transcribed spacer(ITS)부위와 26S rRNA의 D1/D2 domain 부위에 대한 염기서열 분석을 위해 각각 pITSF/R 시발체 및 NL1/4 시발체를 이용하여 분석하였다. 대상이 되는 효모는 skim milk에 넣어 -70℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

  항진균제 감수성 시험은 미국 CLSI M27-A법과 유럽 항균제 감수성 시험위원회에서 제시한 EUCAST의 액체배지미량희석법의 두 가지 방법으로 항진균제 감수성 검사를 실시하였다. 각 균종에 대해 암포테리신 B(amphotericin B), 플루코나졸(fluconazole), 보리코나졸(voriconazole), 카스포펀진(caspofungin), 마이카펀진(micafungin)항진균제를 시행하였으며, 각 실험마다 C. krusei ATCC 6258 및 C. parapsilosis ATCC 22019를 대조 균으로 사용하였고, 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC) 판정은 24시간 배양 후 확인하였으며 필요한 경우 48시간까지 배양하여 판정하였다.

  효모의 항진균제 감수성 시험 방법 중 CLSI 액체배지미량희석법은 플루코나졸, 보리코나졸, 카스포펀진, 마이카펀진의 경우 육안으로 판정하여 대조에 비해 현저히 성장이 억제된 지점(50%까지 억제에 해당)을, 암포테리신 B의 경우 완전 억제된 약제 농도를 MIC로 판정하였다. EUCAST의 경우는 마이크로플레이트를 분광광도계(530 nm)로 측정하여 아졸계 항진균제, 카스포펀진, 마이카펀진의 경우 성장대조의 50% 억제, 암포테리신 B의 경우는 90% 이상 억제된 최소약물농도를 MIC로 판정하였다. 각 균종별, 각 항균제 MIC에 대한 임상적 breakpoint(감수성과 내성의 판정)는 개정된 CLSI와 EUCAST 법에 의해 판정하였다(Table 1).

  연구결과, 수집된 전체 효모 총 37,847주 중 대부분은 Candida spp.(37,767주, 99.8%)에 속하였다. 전체 임상 검체에서 발견된 효모 중 C. albicans 가 18,702주(49.4%)로 가장 흔한 균종이었으며, 그 뒤로는 C. glabrata(2,709주, 7.2%), C. tropicalis(2,450주, 6.5%), C. parapsilosis(1,478주, 3.9%) 순이었다. 또한 드물게 분리되는 다른 칸디다 종과 효모는 병원마다 분리율에 더 큰 차이를 나타내었다(Table 2).

  Table 3은 항진균제 감수성 시험이 실시된 총 1,582주의 균종과 검체를 나타낸 것이다. 대부분의 칸디다 종은 혈액, 소변, 호흡기 검체에서 분리되었으며(81.6%), 국내 병원의 각종 임상검체에서 분리된 칸디다 종 총 1,582주를 대상으로 항진균제 감수성 검사를 실시하였다.

  임상검체에서 분리된 총 1,582주를 대상으로 실시한 항진균제 감수성 시험 결과를 기존의 Clinical breakpoints(CBP)와 개정된 CBP에 의해 판정하고 결과를 비교하였다(Table 4). 플루코나졸 검사 결과는 기존의 CLSI CBP에 의해서는 95.2%(1,507/1,582)가 감수성으로 판정되었으나 새로운 CBP를 적용할 때 82.3%(1,248/1,516)만이 감수성을 보였다. 즉, 기존의 CLSI CBP 기준에 의해 플루코나졸 내성 및 약용량의존감수성 균주는 각각 3.5%(53주) 및 1.4%(22주)이었고, 개정된 CBP에 의해서는 각각 15.4%(234주) 및 2.2%(34주)이었다. 또한 보리코나졸, 카스포펀진, 마이카펀진에 대한 감수성은 99.5%(1,275/1,281), 99.8%(1,534/1,536) 및 99.6%(1,511/1,516)로 높았다.

  총 1,582주를 대상으로 두 가지 방법에 의한 5가지 주요 항진균제에 대해 감수성 시험을 실시한 결과 각 항진균제에 대한 MIC 범위는 Table 5와 같다. CLSI M27-A3법에 의해 24시간 방법으로 판정한 칸디다 종의 암포테리신 B, 플루코나졸, 보리코나졸, 카스포펀진, 마이카펀진에 대한 MIC는 각각 0.03-4μg/mL, 0.125-64μg/mL, 0.03-16μg/mL, 0.015-1 및 0.007-4μg/mL이었다. EUCAST에 의한 결과도 매우 유사하여 두 방법은 모든 항진균제 감수성 시험에서 높은 일치율(2배 희석배수 내)을 보였다. 그러나 EUCAST 시험법은 적용이 가능한 C. albicans, C. tropicalis 및 C. parapsilosis의 경우 CLSI법과 비교하여 항진균제 감수성시험 결과 일치율이 높았으나 C. glabrata 등의 다른 균종에서 적용기준이 없어 CLSI법과 범주 일치율을 비교하기는 어려웠다.


Ⅲ. 맺는 말


  최근 CLSI에서는 항진균제 감수성 시험 결과 판정기준을 칸디다 종 별로 달리 적용하는 새로운 clinical breakpoints(CBPs)를 발표하였다. CBP는 항진균제 치료 반응을 예측하는 임상적 기준이 되는 지표로 제시되고 있다. 본 실험에서 기존의 CLSI CBP 기준에 의한 프루코나졸 내성 및 약용량의존감수성 칸디다 균주 비율이 3.4%에서 개정된 CBP에 의해 18.1%로 증가하는 것으로 확인되엇다. 이는 CLSI 시험법 개정으로 항진균제 내성균의 비율이 증가할 것으로 판단되며 개정된 시험법에 따른 국내 분리 진균에 대한 항진균제 내성율 변화를 지속적으로 분석하여야 할 것으로 사료된다. 또한 EUCAST법은 적용이 가능한 C. albicans, C. tropicalis 및 C. parapsilosis의 경우 CLSI법과 검사 일치율이 높아 두가지 시험법 모두 일부 균종에 대해서는 적용할 수 있을 것으로 판단된다.

IV. 참고문헌


1. Kim SH, Shin JH, Kim EC, Lee K, Kim MN, Lee WG, Uh Y, Lee HS, Lee MK, Jeong SH, Jung SI, Park KH, Lee JS, Shin MG, Suh SP, Ryang DW. The relationship between antifungal usage and antifungal susceptibility in clinical isolates of Candida: a multicenter Korean study. Med. Mycol 2009;47:296-304.
2. Kim MN, Shin JH, Sung H, Lee K, Kim EC, Ryoo N, Lee JS, Jung SI, Park KH, Kee SJ, Kim SH, Shin MG, Suh SP, Ryang DW. Candida haemulonii and closely related species at 5 university hospitals in Korea: identification, antifungal susceptibility, and clinical features Clin. Infect. Dis 2009;48:e57-61
3. Oh BJ, Shin JH, Kim MN, Sung H, Lee K, Joo MY, Shin MG, Suh SP, Ryang DW. Biofilm formation and genotyping of Candida haemulonii, Candida pseudohaemulonii, and a proposed new species (Candida auris) isolates from Korea. Med. Mycol 2011;49:98-102.
4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing. EUCAST technical note on fluconazole. Clin Microbiol Infect 2008;14:193-5.
5. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing. EUCAST definitive document EDef 7.1: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Clin Microbiol Infect 2008;14:398-405.
6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing. EUCAST technical note on voriconazole. Clin Microbiol Infect 2008;14:985-7.
7. Pfaller MA, Andes D, Diekema DJ, Espinel-Ingroff A, Sheehan D. Wild-type MIC distributions, epidemiological cutoff values and species-specific clinical breakpoints for fluconazole and Candida: time for harmonization of CLSI and EUCAST broth microdilution methods. Drug Resist Update 2010;13:180-95.
8. Pfaller MA and Diekema DJ. Progress in Antifungal Susceptibility Testing of Candida spp. by Use of Clinical and Laboratory Standards Institute Broth Microdilution Methods, 2010 to 2012. J Clin Microbiol 2012;50:2846-56.

이 글은 전남대학교 의과대학 진단검사의학과 (신종희 교수)에서 수행한 “항진균제 내성 실태 및 전파기전 연구” 학술연구과제 일부를 요약 정리한 것입니다.