그 양이 제한될 수밖에 없는 인체 유래물에서 직접 추출하는 유전체 DNA를 대신하여 관련 유전체 연구에 활용할 수 있는 DNA를 확보할 수 있는 방법으로 B-임파구에 Epstein-Barr Virus, EBV를 감염시켜 형질전환(transformation)된 불멸화(immortalized) 임파구 세포주를 만들 수 있다. 이를 불멸화세포주(lymphoblastoid cell line, LCL)라 한다. 이 세포주는 개인의 유전자형을 그대로 가지고 있기 때문에 세포주를 배양하여 특정 개인의 유전자형을 가진 DNA를 무한정 생산할 수 있어 유전체 DNA의 재생가능한 공급원으로써 유망한 대안으로 알려져 있다. 전 세계에서 진행되고 있는 수많은 유전체 연구에서는 LCL 시료를 이미 널리 사용하고 있으며, 최근에는 expression phenotype 연구, 약물반응성의 변이 연구 및 약물유전체학 연구 분야로 그 활용분야가 확대되고 있다[1].

  LCL은 인간 DNA의 지속적인 공급원이지만 LCL 자원은 유전적 및 비유전적 불안정성을 가지고 있으므로 주의해서 사용해야 한다. 기존 연구에 따르면 세포배양과 세포상태의 계대(passage) 횟수, EBV에 대한 개개인의 반응 등 비유전적 요인에 의해 영향을 받는다고 알려져 있다. 또한 EBV 감염에 의한 불멸화 과정에서 유전적 변화를 일으킬 가능성도 있다고 알려져 있다[2]. 일부 연구에 따르면 EBV 형질전환 과정에서 유전체 구조에 돌연변이가 발생될 수 있으므로 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)과 복제수변이(copy number variation, CNV) 연구를 위한 믿을 만한 공급원으로 LCL을 사용하기 위해서는 엄격한 정도관리가 필요할 것으로 고려되고 있다. 최근 B-LCL 라인과 parental B 세포로 유전적 교잡(hybridization) 비교 분석으로 안정성을 유지하는 방법이 제시되었지만[3] 장기 계대 배양하는 과정에서의 LCL 안정성에 대해서는 밝혀져 있지 않다.

  질병관리본부 유전체센터에서는 LCL genomic DNA를 혈액 또는 조직 세포에서 추출된 DNA의 대체 자원으로 활용하기 위해 엄격한 정도관리를 통한 비교분석과 장기 계대 배양할 때 발생 시 있는 유전정보의 불안전성을 확인하여 LCL DNA의 대체 자원으로서의 활용 가능성을 확인하고, 이 결과를 바탕으로 LCL DNA에 대한 지침을 마련 중에 있다[4].


Ⅱ. 몸 말

  국립중앙인체자원은행에서는 인체유래물에서 추출하는 유전체 DNA의 제한성을 극복하고 한국인 LCL 자원의 관련 연구 활용성을 확보 하기위해 수집되는 인체자원의 LCL을 제작하여 보유 중이며 관련 연구에 분양을 하고 있다. 이 중 한국인 HapMap 프로젝트에 사용된 90건의 LCL 시료들에서 무작위로 선정된 20건을 약 2년 반에 걸쳐 장기 계대배양(passage 160)을 수행하였으며, 각 계대 단계별로 보유되고 있어 LCL 자원의 장기계대배양에 대한 특성변화 연구에 유용한 자원으로 사용할 수 있다[5].

  본 조사에서는 LCL genomic DNA가 대체 자원으로써의 활용 가능여부와 장기 계대배양을 하면서 발생될 수 있는 유전정보의 불안정성에 대한 탐색이 이루어졌다. 첫째, 국립중앙인체자원은행에서 분양받은 각각의 계대 배양된(각 2, 4, 41, 100, 160 계대) LCL DNA 시료들을 혈액 DNA 시료와 비교 분석하였다. 혈액 DNA와 각 계대 배양된 LCL DNA들을 전장유전체 SNP 칩을 이용하여 약 50 만개 SNP들의 genotype 결과를 혈액 DNA와 각 계대 배양된 LCL DNA들 간에 비교하였다(Figure 1(a)). 전장유전체연관분석연구를 위한 정도관리를 수행하여 두 종류의 DNA 사이의 genotype을 비교했을 때에도 큰 변화를 찾을 수 없었다(Figure 1(b)).

  둘째로, 장기 계대배양에 따른 LCL의 안정성에 대한 확인을 시도하였다. 각 염색체 별로 혈액 DNA 시료와 각 계대 배양된 LCL DNA 시료들 사이에 genotype 차이를 분석한 결과, 후기 passage (>40passages) LCL의 염색체 6p, 16q, 18p, 22q의 4개 지역에서 혈액 DNA와 유전변이 정보 불일치율이 높게 나타나는 것을 발견하였다(Figure 2). 4개 지역들에 대한 심층 분석을 통해 이형접합성 손실(loss of heterozygosity, LOH)이 후기 passage LCL의 유전 정보 불일치의 주요 원인임을 확인하였다. LOH 지역의 존재는 B 대립 유전자 빈도(B-allele frequency, BAF) (약 0.5)로부터 추정된 이형접합성 손실이나 Log R ratio (LRR)의 분석에서 큰 염색체 영역에 copy number가 손실되거나 검출된 것으로 확인하였으며, LRR의 변화는 없었지만 BAF에서 상당히 많은 LOH를 보이는 silent LOH도 찾을 수 있었다. 이 결과로 유전체 분석을 위한 DNA로서 초기 passage LCL 시료는 DNA의 공급원으로 적합하나 장기 계대배양에 따른 후기 passage의 LCL은 신뢰하기 어렵다는 결론을 도출하였다.


Ⅲ. 맺는 말

  최근 인간 질병의 유전적 원인을 규명하기 위한 유전체 연구가 활발히 진행되고 있으나, 정작 이 연구를 위한 시료는 매우 제한되어 있어 그 사용이 제한적일 수밖에 없다. 이런 혈액 또는 조직 시료의 genomic DNA를 대체하기 위해 LCL이 활용되고 있으나 LCL의 장기 계대배양에 따른 불안정성 등은 해당 자원을 연구에 사용하기 전 반드시 적절한 품질관리를 해야 할 필요성을 증가시키고 있다.

  본 연구에서는 1) 대체가능한 공급원으로서 LCL genomic DNA의 활용가능성과 2) 장기 계대배양 했을 때의 LCL 유전정보의 안정성을 탐색하였으며, LCL genomic DNA는 유전체 분석을 위한 대체 자원으로 사용 가능하지만 장기 계대배양의 각 단계 중 후기 passage에서 추출한 LCL DNA는 유전체 구조 변이로 인한 유전 정보의 손상으로 관련 연구에 사용하기에 적합하지 않음을 확인하였다. 따라서 유전체 연구 특히 SNP 분석을 위한 유전체 DNA의 공급원으로 LCL genomic DNA를 사용할 때에는 반드시 초기 계대배양된 LCL 세포주(<40passages)를 이용하는 것이 유전정보의 안정성을 확보할 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Genome-wide SNP assay reveals structural genomic variation, extended homozygosity and cell-line induced alterations in normal individuals. Hum. Mol. Genet. 2007;16, 1-14.
2. Fidelity of SNP array genotyping using Epstein Barr virus-transformed B-lymphocyte cell lines: implications for genome-wide association studies. PLoS ONE 2009;4, e6915.
3. Copy number increase of 1p36.33 and mitochondria genome amplification in Epstein-Barr virus-transformed lymphoblasotid cell lines. Cancer Genet. Cytogenet. 2007;173, 122-130.
4. Genotype instability during long-term subculture of lymphoblastoid cell lines. J.Hum. Genet. 2013;58, 16-20.
5. 질병관리본부. 국립중앙인체자원은행 현황. 주간건강과 질병 2011;5(20):365-371.