Ⅰ. 들어가는 말

  생명공학이 발전함에 따라 동물실험의 급속화가 고도화됨에 따라 있음으로, 정확한 동물실험결과 도출의 중요성이 대두되고 있다. 이에 부응하기 위해서는 철저한 실험동물의 품질관리(quality control)가 중요한 수단이다. 동물실험의 증가와 함께 동물 윤리와 복지의 고려가 강하게 요구되고 있기 때문에 이러한 실험동물의 품질관리는 더욱 엄격하게 이루어져야 한다[1-2]. 실험동물의 품질관리는 크게 미생물학적 관리(microbial control), 유전적 관리(genetic control) 및 환경적 관리(environmental control)로 구분된다. 
임상적으로 문제를 일으키지 않더라도, 병원균을 보유하고 있는 실험동물을 실험에 사용할 경우 실험결과에 많은 영향을 초래하여 신뢰할 수 있는 실험결과를 얻을 수 없기 때문에 많은 경제적, 시간적 손실을 입게 된다. 이미 국내 대학이나 연구소, 기타 상업적 목적으로 운영되는 실험동물시설에서도 자체 기준에 따fms 미생물적, 유전적, 환경적 모니터링을 실시하고 있으며, 이에 따른 보고가 이루어지고 있다. 미국, 영국, 일본 등에서는 동물실험실 내 실험동물의 미생물 상태에 대한 여러 프로그램을 운영하여 실험동물의 효과적인 관리에 이용하고 있다. 이러한 프로그램들은 병원체 자체를 검출하거나 감염에 의해 생성된 항체를 조사하여 간접적으로 병원체의 유무를 판단하는 실험실적 방법을 가장 많이 사용하고 있다[1-4].
  질병관리본부 내 실험동물을 이용한 연구 수행과제는 매년 증가하는 추세로 일 년에 약 55개 과제와 약 10,000여 마리의 실험동물이 사용 되는 것으로 조사되었으며, 동물보호법(타법개정 2013.03.23)에 근거하여 고통의 종류에 따른 동물사용 분류에 따르면 대부분이 척추동물을 대상으로 고통이나 억압을 동반하는 실험(Grade D)으로 사용되었고, 그 중 감염 실험은 생물안전 2-3등급 동물실험시설의 사용을 포함하여 약 70% 이상을 차지하고 있다(Table 1).

  질병관리본부의 실험동물 연구시설은 실험동물의 생리적・병리적 변화를 관찰하기 위한 청정동물실(specific pathogen free area, SPF area)과 여러 가지 병원체를 이용하는 감염동물실(animal biosafety level 2 area, ABL-2 area)로 구성되어 있다. 이들 구역은 별도의 설비와 공간으로 분리되어 운영되고 있으며 사용되는 다양한 실험동물은 모두 국내・외 실험동물 생산 시설로부터 공급받고 있으므로 다른 동물실험 기관과 비교하여 실험동물의 품질관리에 더 많은 주의와 관리가 필요하다. 실험동물에 예기치 않은 감염이 발생되면 실험동물의 행동, 성장률, 장기중량, 면역반응, 종양발생, 효소활성도 같은 biological parameter의 변화 또는 유병률 및 사망률 등과 같은 감염실험결과들에 많은 영향을 줄 수 있다[3-6]. 따라서 감염동물실 내 미생물 모니터링은 정밀한 조작을 통하여 얻은 연구결과 만큼이나 중요한 과정으로, 연구결과에 높은 신뢰성과 재현성을 확고하게 보증해주는 자료 확보 목적으로 수행되었다.
본 원고에서는 질병관리본부 실험동물실의 SPF 구역과 ABL-2 구역에서 진행되는 동물실험과 관련하여 수행된 미생물모니터링 결과를 토대로 관리현황을 기술하였다.


Ⅱ. 몸 말

  기후, 주거, 영양, 생물학적 및 물리-화학적 요인 등과 같은 환경적 요인은 실험동물의 번식 및 실험결과에 많은 영향을 미친다고 알려져 있으며 신뢰할만한 연구결과의 지속적 도출을 위하여 SPF 구역과 ABL-2 구역에서 3개월의 관찰기간 동안 매일 온도, 습도 및 차압 항목을 모니터링하였다. 온도, 습도 및 차압은 자동제어시스템에 수집된 디지털센서 측정값을 사용하였다.
보초동물인 Balb/cSlc-nu/nu (nude mice)마우스의 동물실 내 미생물에 대한 노출을 최대화하기 위하여 다른 케이지에서 이미 사용한 깔짚을 보초동물을 사육하고 있는 케이지에 필요한 깔짚 양의 1/2 씩 분배하고, 나머지 1/2는 새로운 깔짚을 공급하였다. 같은 방법으로 보초동물을 3개월간 지정된 동물실에서 사육한 후, 모니터링 분석을 실시하였다. 보초동물을 각각 4주, 8주 및 12주간 지정된 동물실에서 사육하고, 부검일에 해당동물을 Ether로 마취하였다. 1㎖ 주사기를 이용하여 심장으로부터 약 0.5 ㎖의 혈액을 채취한 후, 셀로판 테이프법을 이용하여 항문주위의 요충 충란을 확인하고, 외부기생충 관찰을 위해 마우스의 귀 부위를 절단하여 해부현미경으로 검경하여 관찰하였다. 면봉을 이용하여 콧속 내용물, 맹장, 십이지장, 기관지 내용물을 MacConkey 및 혈액한천배지에 접종하여 배양하였다. 채혈한 혈액은 실온에서 30분 이상 방치하여 혈액을 응고시키고, 4,500rpm에서 20분간 원심분리하여 상층의 혈청을 분리한 후, Table 2와 같이 미생물에 대한 항체가를 측정하였다(Table 2).

  확보한 혈청을 Table 2와 같이 Bordetella bronchiseptica 및 Corynebacterium kutscheri 항원을 이용한 응집반응(agglutination reaction)을 실시하였고, 각각의 ELISA kit를 이용하여 프로토콜(protocol)에 따라 수행한 후, THERMO max microplate reader (Molecular Devise, USA)로 492 nm에서 흡광도를 측정하여 판정하였다.
실험기간 동안 자동제어 프로그램을 통해 실시간 온도, 습도 및 실간 차압의 변화를 기록하여 실험동물실 운영기준 (온도: 19～23°C, 습도: 40～70%, 차압: SPF구역>0mmH2O, ABL-2구역<0mmH2O)의 허용범위 내에 있는지 확인하였다. ABL-2 구역에서는 실험기간 동안 온도, 습도 및 차압은 각각 21.8～23.9°C, 53.1～72.2% 및 -11.9～-25.7mmH2O의 변동범위를 나타냈으며, SPF 구역에서는 실험기간 동안 온도, 습도 및 차압은 각각 22.5～23.9°C, 47.5%～67.5% 및 13.2～15mmH2O의 변동범위를 나타내어 실험동물실 운영기준의 허용범위 내에서 유지되었다. 특히 생물학적위해물질을 이용한 감염동물실험을 수행하는 ABL-2 구역의 차압이 평균 -10mmH2O 이상을 유지함으로써 동물사육실간 오염 뿐 아니라 동물실험수행자에 대한 보호를 위한 환경기준에 적합하였다(Figure 1).
보초동물인 Balb/c-nu/nu mice를 각각 ABL-2 구역과 SPF 구역에서 12주 동안 사육하면서 분비물, 피모상태 및 색깔, 행동변화 등의 일반증상을 관찰하였으나 모든 동물에서 이상증상은 관찰되지 않았다. 간, 비장, 신장 및 폐에서 Pasteurella pneumotropica, Salmonella spp., E. coli O115a,c:K(B)(Citrobacter rodentium), Corynebacterium kutscheri, Pseudomonas aeruginosa, Dermatophytes spp. 에 대한 배양검사를 수행한 결과 어느 장기에서도 병원성 미생물은 검출되지 않았다. 피부, 십이지장 및 맹장 점막과 내용물에 대한 직접도말시험법으로 기생충인 Pinworm, Intestinal protozoa 및 Ectoparasite를 광학현미경 하에서 검경하였으나, 모든 동물에서 내․외부 기생충은 검출되지 않았다. 직접적인 분리․동정이 어려운 Helicobacter hepaticus, Helicobacter bilis 및 Pneumocystis carinii 에 대하여는 동결 위 및 폐 조직에서 total RNA를 추출하여 PCR 검사를 수행하였다. 그 결과 위 및 폐조직에서 Helicobacter hepaticus, Helicobacter bilis 및 Pneumocystis carinii는 검출되지 않았다(Table 3).

  본 조사에서는 선천적 흉선 기형으로 T cell 면역이 억제되어, 보초동물로 많이 쓰이는 nude mice를 공시동물로 선정하고, 생물학적 위해물질 사용구역인 ABL-2 구역과 청정동물실인 SPF 구역에서 각각 4주, 8주 및 12주간 사육하였다. 또한 동물실 내 미생물에 오염될 수 있는 환경을 조성하기 위해 cage 등 사육기자재의 교환주기를 연장 및 교환시에도 사용한 깔짚을 새로운 깔짚과 혼용함으로써 장기 오염에 노출될 수 있도록 사육환경을 조성하여 미생물 모니터링을 진행하였다. 모니터링 결과, 실험동물의 건강에 영향을 미치는 병원성 미생물 및 원충의 감염은 인정되지 않았다. 따라서 질병관리본부 실험동물실은 병원성 미생물로부터 안전하게 유지․관리되고 있음이 증명되었다. 그러나 ABL-2 구역에서는 장기간 여러 종류의 병원체를 사용한 감염실험이 진행되므로, 감염 동물실험 모델의 경시적인 생리학적 특성 분석과 미생물학적 특성 분석조사를 추가적으로 진행하였다.

  반복적인 감염실험을 실시하는 ABL-2 구역의 미생물 오염도를 조사하기 위해 현재 가장 많이 사용되고 있는 Balb/c와 C57BL/6 마우스를 선정하여 암․수 각각 189마리씩을 12주 동안 사육하면서 1일1회 일반증상을 관찰하고, 1주1회 체중을 측정하였다. 12주째에 혈액을 채취하여 전혈은 Advia 2120(Bayer, Leverkusen, Germany)를 사용하여 red blood cell (RBC), white blood cell (WBC), hemoglobin (HGB), hematocrit (HCT), mean corpuscular volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH), mean cell hemoglobin concentration (MCHC), platelet (PLT) 및 mean plasma volume (MPV)을 계수하였고, 혈청은 HITACHI 7080 autoanalyzer(HITACHI, Tokyo, Japan)를 사용하여 glucose, total protein, albumin, triglyceride, total cholesterol, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), creatinine, blood urea nitrogen(BUN), total-bilirubin, calcium, phosphorus를 측정하였다.
이후 부검하여 채취한 간, 비장, 신장, 심장 등의 주요 장기에 대한 조직병리학적 검사를 수행하여 ABL-2 구역 내에서 장기간 사육이 실험동물의 건강상태에 미치는 영향을 조사하였다.
12주간의 사육기간 동안 모든 실험군에서 1-2마리의 실험동물이 폐사하였으나 부검 후 실시한 조직병리학적 검사결과, 감염원에 의한 병리적 반응은 관찰되지 않았으며 주로 개별환기 사육장비의 음수공급 불량 등이 원인으로 조사되었으며, 12주간 체중을 측정한 결과, 이상변화는 관찰되지 않았다(Figure 2).

  Balb/c 수컷 및 암컷 마우스의 평균 사료섭취량은 각각 3.4 g/day 및 2.9 g/day를 나타냈고, C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스는 각각 3.1 g/day 및 2.6 g/day을 나타내어 ABL-2 구역의 실험동물은 연령대비 정상적인 양의 사료를 섭취하고 있는 것을 확인하였다(Figure 3).
ABL-2구역에서 사육된 Balb/c 마우스와 C57BL/6 마우스의 혈액학적 검사결과 동물 종에 따른 차이는 관찰되지 않았으며, 실험동물 공급업체에서 제공한 정상 생리치와 비교에서는 RBC, WBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT 및 MPV 값이 다소 높게 측정되는 경향을 나타냈으나 이는 채혈 시료량 부족 및 채혈 후 응고반응으로 인한 기기 측정값의 오차로 판단된다. 혈액생화학적 검사결과에서는 암컷 및 수컷 Balb/c 마우스에서 측정된 ALP, AST 및 ALT의 측정값이 동물공급업체에서 제공한 기초데이터 값 보다 증가하는 경향을 나타냈다. 이러한 경향은 수컷과 암컷 마우스 모두에서 나타났으며, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) 및 total cholesterol (T-CHO)의 측정항목에서는 감소하는 경향을 나타냈다. 이전에 보고된 문헌자료와 비교했을 때, 정상 변동범위를 나타내어 혈액학적, 혈액생화학적인 임상수치의 변화는 없는 것으로 확인되었다.
주요 장기조직에 대한 병리조직학적 검사결과, ABL-2 구역에서 사육된 Balb/c 및 C57BL/6 마우스에서는 대부분의 개체에서 폐충혈 (pulmonary hyperemia), 폐 조직의 외관상 갈색 변화 등이 관찰되었으며, 그 이외의 장기조직에서는 정상적인 조직학적 구조를 나타냈다. 폐는 기관(trachea), 기관지(bronchus, bronchiole) 및 폐포(alveoli)로 구성되어 있는 호흡기관이다. 본 조사결과 폐 실질에서는 다량의 RBC가 분포되어 있는 폐 울혈(pulmonary conjestion) 소견이 관찰되었고, 폐포벽 비후와 함께 폐포벽 주위에는 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocytes)가 중등도로 분포하여 폐울혈과 함께 경도의 폐렴소견이 관찰되었다(Figure 4)[7]. 이러한 병리조직학적인 변화는 개별환기형 사육장치에서 사육함으로 인한 케이지 내 환기장애 또는 과환기에 의한 변화로 추정된다. 그러나 보다 확실한 원인결과를 추정하기 위해서는 보다 많은 개체의 건강모니터링 조사가 이루어져야 할 것으로 판단되었다.

  ABL-2 구역에서 각각 4주, 8주 및 12주간 사육한 암·수 실험동물을 이용하여 기관 점막과 맹장내용물을 도말하여 기관지 점막 도말시료를 blood agar plate (BAP) 배지에, 맹장내용물은 Salmonella-Shigella plate (SS 배지) 및 MacConkey 배지에 접종하여 계대 배양한 후 그람염색(Gram stain)과 Corynebacterium kutscheri에 대한 항원응집반응을 수행하였다. 그 결과 기관지 내용물에서는 Staphylococcus xylosus가 동정되었으며, 맹장내용물에서는 Escherichia coli와 Proteus mirabilis가 동정되었다. 일반적으로 랫드, 마우스, 토끼 등의 설치류에서 기관지염을 유발하는 것으로 알려진 Corynebacterium kutscheri에 대하여 항원응집반응을 수행한 결과 ABL-2 구역에서 장기간 사육한 Balb/c 및 C57BL/6 마우스에서도 항원응집반응 음성을 나타냈다(Figure 5)[8-9].
Staphylococcus xylosus는 개, 염소, 양 등의 피부에 상재하는 균으로서 다른 동물과 사람에게는 거의 감염되지 않는 것으로 알려져 있다. Escherichia coli와 Proteus mirabilis는 상재균으로서 실험동물에 대한 위해성은 거의 알려져 있지 않으며, 사람에서 Proteus mirabilis에 의한 식중독 등을 유발하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 질병관리본부 ABL-2 구역에서 감염실험동물과 함께 사육하여 미생물모니터링을 수행한 결과 검출된 Staphylococcus xylosus, Escherichia coli 및 Proteus mirabilis는 실험동물과 사람에 위해성은 인정되지 않는 상재균으로서 실험동물실의 청정도 유지에는 큰 영향을 미치지 않으나, 잠재적으로 병원성을 나타낼 가능성이 있으므로, 청소 및 소독에 더 많은 관심과 주의를 기울여야 할 것으로 판단된다[9-10].


Ⅲ. 맺는 말

  마우스에서 불현성 감염을 일으키는 주요한 질병으로는 Salmonellosis, Mycoplasma, Tyzzer 병, Sendai 바이러스병, 마우스 간염 등이 알려져 있으며, 이러한 질병은 각종 약물과 스트레스, 그리고 환경적 요인 등에 의한 2차 감염의 원인이 된다. 이들 병원체는 불현성 감염을 보이기 때문에 외관상으로 감염을 확인하기가 어려우며, 근절이 어려워 실험동물 질병의 관리에 많은 어려움을 야기한다. 특히 Sendai 바이러스, Mycoplasma, 마우스 간염 등은 감염이 발생했을 때, 집단의 90%이상의 동물이 수일내에 감염되며 유전자변형마우스 등의 특수동물에서는 치명적인 질병을 야기할 수 있다[11].
본 조사에서는 질병관리본부 SPF 구역과 ABL-2 구역에서 환경모니터링과 보초동물을 이용한 미생물모니터링검사를 수행하여 병원성 미생물에 오염되지 않았음을 검증하였다. 이후 실제로 질병관리본부 실험동물실에서 가장 사용빈도가 높은 Balb/c 및 C57BL/6 마우스의 두 계통을 선정하여 실험동물을 장기간 사육하였을 때 건강상태를 평가하기 위하여 조직병리학적 검사를 수행한 결과 실험동물실의 격리사육케이지와 개별환기케이지에서 사육된 실험동물은 폐에서 나타난 폐울혈 소견 외에는 실험동물의 건강에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않아 동물실험시설로서 환경 및 미생물 컨트롤이 잘 이루어지고 있는 것으로 판단하였다. 다음으로 ABL-2 구역의 감염동물실험이 장기간 진행되고 있는 동물실에 Balb/c 및 C57BL/6 마우스를 장기간 함께 사육하여 사육실 내에서 진행되는 감염실험에 의한 오염여부를 평가하고자 하였다. 그 결과, 사람 및 실험동물에 위해성을 가진 병원성 미생물은 검출되지 않았으며, 실험동물에서 잠재적으로 병원성을 야기할 수도 있는 피부 및 내장 상재균(Staphylococcus xylosus, Escherichia coli, Proteus mirabilis)이 검출되었으므로, 실험동물실의 청소 및 소독에 보다 많은 주의를 기울여야 할 필요성이 있는 것으로 판단되었다.

  질병관리본부 실험동물실에서는 청정동물, 일반동물, 유전자변형동물을 이용한 감염실험과 생리활성실험이 다수 진행되고 있다. 특히 감염 동물실험은 여러 가지 요인이 복합적으로 작용하여 실험동물의 병리적 변화를 초래할 가능성이 있고, 실험처치에 따라 질병의 병원성이 증폭되는 일이 많으므로 동물의 윤리와 복지 차원에서도 문제시 되는 실험동물의 감염성 질병을 예방하고, 근절하는 대책을 마련하는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다. 이를 위해서는 동물을 사육하는 시설의 환경적 요인을 항상 일정하게 유지하는 것이 매우 중요하며, 시설 및 실험동물의 오염을 예방하기 위해서라도 감염 동물실 내의 엄격한 실험동물의 건강 모니터링 및 미생물 모니터링의 수행 및 결과의 검토가 반드시 수반되어야 한다.
이번 조사를 통하여 질병관리본부 실험동물실은 환경 및 미생물학적 요인이 실험동물의 건강에 영향을 미치지 않도록 관리되고 있음을 알 수 있었다. 이러한 환경 및 미생물학적 모니터링을 모든 사육실을 대상으로 주기적으로 수행하여 실험동물의 생명과 건강에 영향을 주는 생물학적 인자를 규명하고 제거함으로써, 실험동물과 사람의 질병을 예방하고 실험결과의 재현성, 정확성을 유지하고 더 나아가 우발적으로 실험동물로부터 야기되는 실험실 획득감염을 사전에 예방하여 안전한 동물실험의 신뢰도를 한 단계 더 높이는 밑거름이 될 수 있을 것이다.


IV. 참고문헌

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