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인체자원 정도관리용 표준물질 제작 및 정도관리 숙련도 시험 운영
  • 작성일2014-09-18
  • 최종수정일2014-09-18
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7166
인체자원 정도관리용 표준물질 제작 및 정도관리 숙련도 시험 운영
Development of Quality Control Standards and Operation of Proficiency Test

질병관리본부 국립보건연구원 유전체센터 생물자원은행과
김혜련

Abstract


Background: The purpose of this study was to produce a reference material of purified Human genomic DNA (gDNA) of K562 cell line and to progress proficiency testing.
Methodology: Human gDNA was extracted through standard operating protocol according to ISO Guide 34. Homogeneity study was performed with 20 vials and triplicates per vial. Short-term stability measurements were performed at four different temperatures (-75, -20, 4, 20 ℃) for up to 21 days. The homogeneity and stability of the material were assessed through agarose gel electrophoresis of gDNA and determination of the quantification of gDNA per vial.
Results: All samples used in the homogeneity and short-term stability study were analyzed through agarose gel electrophoresis of gDNA and observed the single band. Quantification analysis of gDNA in homogeneity and short-term stability study was performed using MS Excel single factor ANOVA. The reference material was stable at four different temperatures and was homogenized.
Conclusion: In this study, we are trying to make or develop a reference material depending on procedures and instructions suitable for this situation in Korea. These results will be used as basic information to evaluate agencies as manufacturers of certified reference materials.


Ⅰ. 들어가는 말


  생명공학기술이 발전함에 따라 다양한 질병의 원인규명, 진단법 및 치료법 개발에 대한 연구가 증가하고 있으며, 이에 따라 인체자원에 대한 수요도 지속적으로 증가하고 있다. 질병관리본부 국립보건연구원 생물자원은행과는 국립중앙인체자원은행의 운영을 통해, 한국인에서 발생하는 다양한 질병의 원인 규명과 진단법, 치료법 개발 등 보건의료분야 연구에 활용될 대규모 인체자원의 확보, 관리 및 분양을 수행하고 있다. 또한, 한국인체자원은행사업(2008-현재)을 통해 17개 인체자원단위은행에서 질환자 인체자원을 수집 및 분양하고 있다.

수백에서 수천 명 이상의 인체자원을 활용한 large-scale 연구는 최근 그 수가 급격히 증가하고 있으며, 이러한 연구는 대부분 하나의 기관이 아닌 여러 기관에서 인체자원을 확보하여 진행하고 있다. 그러나 표준화되지 않은 인체자원을 사용할 경우 연구결과의 불일치로 인해 연구결과의 통합분석 불가 등의 문제를 발생시켜 잘못된 연구결과가 도출될 가능성이 높아 인체자원 품질의 표준화에 대한 필요성과 중요성이 크게 대두되고 있다. 생물자원은행과는 한국인체자원은행네트워크의 인체자원 품질 표준화를 위해 인체자원은행 자원관리 표준지침과 인체유래물은행 질환자원 임상정보수집 표준화를 위한 가이드라인을 발간하여 지속적으로 보급 및 교육을 수행하고 있다.

본 사업에서는 인체자원 정도관리용 표준물질을 제작하여 정도관리 숙련도 시험을 운영함으로써 인체자원 품질관리의 정확성과 정밀성을 향상시키는 한편, 한국인체자원은행네트워크 내 17개 단위은행의 숙련도 편차 식별 및 원인파악을 통해 정도관리 수행능력을 향상시켜 인체자원관리의 표준화 및 질적 향상을 도모하고자 하였다.

미국, 독일 등 선진국들은 이미 표준물질 개발에 심혈을 기울여 다양한 종류의 표준물질을 보급 활용함으로써, 측정의 정확도 향상 뿐 아니라, 인체자원의 확보, 관리에도 일익을 담당케 하고 있다. 또한 인증표준물질에 대한 중요성이 인식되면서 국제표준화기구(ISO)에서 표준물질위원회(Committee on Reference Material, REMCO)를 구성하여 국제적으로 통용할 수 있는 인증표준물질 개발 및 관련 공인규격들을 확립하고 있다.

미국의 NIST(National Institute of Standard and Technology)에서 구매할 수 있는 인체자원 표준물질로는 SRM 2372, Human DNA quantification standard 등이 있으며, DNA 양 측정의 표준으로 활용되는 SRM 2372의 경우 human buffy coat에서 분리한 세 가지 DNA component로 구성되어 있으며, NIST의 검증 및 인증을 마친 표준물질이다. 그러나 RNA의 경우 NIST에서 인증하고 판매하고 있는 인증표준물질은 없는 상황이며. Stratagene 등과 같은 기업체에서 microarray gene-profiling experiment와 같은 실험에 reference로 사용하기 위해 제작하여 판매하고 있다. 이 물질은 ISO guide 34 등에 따라 만들어지지 않아 인증표준물질(certified reference material)이 아닌 자체적 보정물질로 판단해야 한다.

국내에서는 한국표준과학연구원 등 정부출연 연구소를 중심으로 여러 가지 인증표준물질들을 개발하였으나 인체자원의 질 관리에 활용할 수 있는 표준물질은 없는 실정이다.
본 사업에서는 ISO Guide 34의 요구사항에 따라 genomic DNA 자원의 정도관리에 reference로 사용할 수 있는 Human genomic DNA(gDNA) 인증 후보 표준물질을 제작하고[1,2,3 and 4], 17개 단위은행을 대상으로 숙련도 시험을 운영하기 위한 업무를 수행하였으며, 이 보고를 통해 한국인체자원은행사업을 주관하고 있는 생물자원은행과의 인체자원 표준화 결과와 성과를 확산하고자 한다.

Ⅱ. 몸말


DNA 표준물질 제작
  Human gDNA 표준물질은 human K562 세포주를 원료물질로 사용하여 DNA를 추출하여 제작하였다. 표준물질 제작에 사용한 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였으며, 표준물질의 소급성을 유지하기 위하여 원료물질인 K562 세포주에 대한 STR(short term repeat) profile 분석을(Figure 1) 통해 K562 세포주임을 검증하였다. K562 STR profile은 Table 1과 같다.

균질성 평가
  균질성은 제작된 Human gDNA 표준물질 중 20바이알을 무작위로 선정하여 DNA quantification과 DNA integrity의 두 가지 항목을 평가하였다[1]. DNA quantification은 Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)장비를 사용하여 측정한 DNA quantification을 측정하였고, ANOVA 분석을 수행하였다(Table 2). 표준물질의 quantification은 95% 신뢰구간에서 F비(F)가 F 기각치(F crit) 보다 작고, p-value가 0.05 이하인 조건을 만족하였고(Table 3), Agarose gel 전기영동을 통해 DNA integrity를 확인한 결과 Figure 2의 21번부터 40번째 바이알까지 단일 밴드를 확인하였다(Figure 2).

단기 안정성 평가
  표준물질에 대한 온도의 영향 및 적절한 운송조건을 결정하기 위하여 4개의 다른 보관온도 조건(-75℃, -20℃, 4℃, 22℃)에서 각각 0일, 3일 7일, 14일, 21일을 저장한 후 DNA quantification, DNA integrity를 측정하여 단기 안정성을 분석하였다[2]. DNA quantification 분석은 각 온도별로 일원배치법을 사용하여 ANOVA 분석을 수행하였고, 그 결과 -75℃, -20℃, 4℃, 22℃의 모든 온도조건에서 21일까지 안정한 것을 확인할 수 있었으며(Table 4), DNA integrity 또한 모든 온도조건에서 21일까지 안정한 것을 확인할 수 있었다(Figure 3).

숙련도 시험 실시
  본 사업은 균질성 및 단기 안정성이 확보된 Human gDNA 표준물질을 사용하여 17개 인체자원단위은행 및 인체유래물은행 관련기관을 대상으로 DNA quantification 항목의 수행능력을 평가하는 숙련도 시험을 진행하였다. 숙련도는 숙련도 참여기관에서 제출한 결과를 로버스트분석 방법으로 Z-score를 산출하여 평가하였다[5]. 1개 기관을 제외한 16개 기관에서 ‘만족’의 평가를 받았다(Figure 4). 1개 기관은 장비관리 미흡으로 ‘의심’ 평가를 받았으며, 장비 검·교정 후 숙련도 시험을 추가로 실시한 결과 ‘만족’ 평가를 받았다.

Ⅲ. 맺음말


  본 사업에서는 Human gDNA의 균질성 및 단기안정성 평가를 통해 표준물질의 적절성을 확보하였고, 이를 향후 인증표준물질 생산기관 인증을 위한 기초자료로 활용하고자 장기안정성 평가를 진행중이며,표준물질 생산에 필요한 절차 및 지시서를 마련하고 있다. 이번 사업으로 제작된 표준물질과 생산 지시서, 절차서 등은 향후 국립중앙인체자원은행이 진행할 숙련도 시험 프로그램에 활용될 예정이며, 나아가 표준물질을 지속적으로 제작·활용할 수 있는 토대를 마련하게 될 것이다. 전체적으로 인체유래물 표준화에 관련된 표준물질의 제작과 숙련도 시험의 운영은 글로벌스탠다드에 부합하는 자원관리 및 인체유래물은행의 표준화 향상에 크게 기여할 것으로 기대하고 있다.

Ⅳ. 참고문헌


1. van der Veen AMH, Linsinger TPJ, Pauwels J. 2001. Uncertainty calculations in the certification of reference materials. 2. Homogeneity study, Accreditation Quality Assurance 6. 26-30.
2. van der Veen AMH, Linsinger TPJ, Pauwels J. 2001. Uncertainty calculations in the certification of reference materials. 3. Stability study, Accreditation Quality Assurance 6. 257-263.
3. van der Veen AMH, Linsinger TPJ, Schimmel H, Lamberty A, Pauwels J. 2001. Uncertainty calculations in the certification of reference materials. 4. Characterisation and certification, Accreditation Quality Assurance 6. 290-294.
4. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards (revised 2004). 2006. WHO Technical report series, No. 932.
5. The International harmonized protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories (IUPAC technical report). 2006. Pure Appl Chem. 78(1):145-196
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