Abstract

Botulism is a neuronal disease with flaccid paralysis caused by botulinum toxin which was produced in Clostridium botulinum, a gram-positive anaerobic bacteria.
Botulinum toxin as a biological warfare has begun to be developed as early as 1930s by Japanese Unit 731. US and other nations produced this toxin as a weapon during World War II. Botulinum toxin is one of Category A select agents in US Center for Disease Control and Prevention (CDC) because it is the most toxic material on earth. In Korea, botulism was designated as a category 4 national notifiable infectious disease in 2002, therefore, clinical surveillance and laboratory diagnosis of suspected samples have been continued until now.
Suspected patients are promptly to be reported to Korea Center for Disease Control and Prevention (KCDC) and clinical samples should be transported to the Division of High-risk Pathogen Research of KNIH/KCDC. Laboratory diagnosis of botulism consist of series of procedures; Mouse bioassay, toxin ELISA, bacterial identification and genetic analyses such as conventional/Real-time PCR. While the mouse bioassay has been the gold standard test for the detection of botulinum neurotoxins, alternative tests have been explored to circumvent the ethical concerns related to the use of laboratory animals. Some tests were comparable to mouse bioassay in terms of sensitivity and rapidity, however, the points that eight types of toxin can not be identified simultaneously and sample matrix is limited have become a drawback so far. In 2004, Korea National Institute of Health (KNIH) had developed multi-window rapid test kit to detect botulinum toxin from environmental samples such as unknown white powder. The kit has been successfully used in the field.
Although botulism is not contagious, only a tiny amount of bioweapon might induce a fatal results, a governmental surveillance network and laboratory diagnosis of botulism should be intensified. Also, a sustainable investment on research of effective therapeutics and vaccines should be continued to reinforce national defense ability against bio-terrorism using botulinum toxins.



Ⅰ. 들어가는 말


  보툴리눔 독소증은 이완성 신경마비(Flaccid paralysis) 질환으로, 병의 원인물질은 Clostridium botulinum이라는 그람양성의 혐기성 세균에서 생성되는 강력한 단백질 독소성분이다. 보툴리눔 독소증을 의미하는 영문 "Botulism"은 소시지를 의미하는 라틴어 “Botulus”에서 유래하였다. 18세기 유럽에서는 나폴레옹 전쟁의 영향으로 인해 경제적으로 피폐해지고 식품위생에 대한 관심이 낮아지면서, 보툴리눔균이나 포자가 충분히 불활화되지 않은 상태의 소시지가 유통되었다. 이러한 소시지 내부의 혐기상태에서 보툴리눔균의 포자가 증식하여 독소를 생성하고, 그 소시지를 섭취한 사람이 독소에 중독되는 예가 많았다[1]. 1793년 독일에서 소시지를 섭취한 13명 중 6명이 사망한 outbreak 기록이 대표적인 예이다.

이후 19세기 초, 독일인 내과의사인 Justinus Kerner가 많은 환자들의 임상 자료들을 체계적으로 연구하여 연구논문으로 발표하였고, 이로 인해 보툴리눔 독소증은 “sausage poisoning”으로 지칭되었다[2]. 1895년 미생물학자 Emile Pierre Marie van Ermengem이 벨기에에서 훈제 햄을 먹고 발생한 outbreak 환자에서 혐기세균인 Bacillus botulinus(나중에 Clostridium botulinum으로 명명됨)를 최초로 분리하여 1897년에 발표하였다. 1904년 독일에서는 캔으로 제조된 흰콩을 섭취한 21명 중 11명이 사망한 outbreak가 발생하였고, 균이 G. Landmann에 의해 분리되었다.
 
이후 1910년에 J. Leuchs가 Ermengem과 Landmann에 의해 분리된 두 가지 세균을 비교한 결과 서로 특성이 다르다는 것을 확인하였고, 1919년 스탠포드대학의 Georgina Burke에 의해 보툴리눔균 A형과 B형으로 각각 지칭되었다. 1928년에 보툴리눔 독소가 확인되었고, 1949년에는 독소의 발병기전이 밝혀졌다. 흥미롭게도 이 강력한 독소의 작용기전을 이용하여, 1989년에는 Allergan사의 "BotoxⓇ"가 사시를 치료하는 치료제로 미국 FDA의 허가를 받았고 2002년에는 미간 주름을 개선하는 치료제 기능에 대한 추가 허가를 받았다.

Ⅱ. 몸말

  보툴리눔 독소가 생물무기로 개발되기 시작한 것은 1930년대에 일본의 만주점령 당시 731부대에 의해 행해진 인체실험에서부터였다. 제2차 세계대전 중에는 미국과 구소련을 비롯한 여러 나라에서 생물무기로서 개발 및 방어를 위한 연구가 이루어지기도 하였다. 미국의 경우 1969-1970년도에 걸친 닉슨대통령의 공격용 생화학무기 폐기명령에 따라 보툴리눔 생물무기도 폐기된 것으로 보고되었고, 구소련의 경우 1992년도까지도 보툴리눔 독소 생물무기의 존재가 옐친대통령을 통해 확인되기도 하였다. 비교적 최근인 1995년 일본의 옴(Aum) 진리교 집단에 의한 도쿄역 지하철 테러사건 때에 범인들은 사린 신경가스와 함께 보툴리눔 독소 살포를 계획하였다고 주장하여 이 독소에 대한 경각심을 다시금 일깨웠다[1, 2, 3].

보툴리눔균은 포자를 생성하는 절대 혐기성 세균으로 전 세계적으로 토양과 수계에서 널리 분포하고, 폭이 0.5-2.0㎛, 길이가 1.6-22㎛로 운동성이 있는 그람양성세균이다. 보툴리눔균 이외에도 Clostridium baratii, C. butyricum 균 등이 보툴리눔 독소를 생성할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 보툴리눔 독소는 혈청형에 따라 A에서 H까지 8가지 혈청형을 가지고 있고, 각각의 혈청형은 30가지 이상의 아형으로 나뉜다. 독소형은 사람을 포함한 여러 가지 동물의 종류에 따라 독성이 다르게 나타나며, 사람에서 보툴리눔 독소증을 유발하는 혈청형은 A, B, E, F, H 등 5종이다. H형의 경우 2013년 반세기만에 미국의 한 유아 환자에서 분리되어 학계에 보고되었고, 현재까지 개발된 항독소 치료제에 대해 반응성이 없는 새로운 타입으로 알려져 있다. H 혈청형은 공개될 경우 생물테러에서 악용될 위험성이 매우 높기 때문에 유전자 서열정보도 현재까지 비공개 상태이다.

보툴리눔 독소는 지구상에 알려진 독성물질 중에서 가장 치명적인 것으로 보고되고 있다. 강력한 독성 때문에 미국 질병관리본부(CDC)에서는 생물테러 가능한 병원체 중 탄저균 등과 함께 가장 위험한 카테고리 A 물질로 분류하고 있다. 국내에서는 2002년부터 보툴리눔 독소증을 법정 제4군 법정감염병으로 지정, 의심환자 발생 시 신고할 수 있는 시스템을 구축하여 환자발생 상황을 지속적으로 모니터링하고, 의사환자 시료에 대한 실험실진단을 진행하고 있다. 2010년 개정된 “감염병의 예방과 관리에 관한 법률”에서는 보툴리눔균이 생물테러에 악용될 수 있는 “고위험병원체”로 지정되어 병원체 관리 및 보툴리눔 독소증 환자 발생에 대한 감시가 한층 강화되었다.

보툴리눔 독소는 거울상과 같은 NTNH(Non-toxic Non-hemagglutinin)의 보호를 받고 있는 중쇄(Heavy chain, 100kDa)와 경쇄(Light chain, 50kDa)(Figure 1A) 및 Hemagglutinin으로 구성되어 있다[4]. 보툴리눔 독소의 작용기전을 살펴보면 Figure 1B와 같이 정상적인 경우, 근육이 수축하기 위해서는 신경세포에서 아세틸콜린이라는 신경전달물질이 분비되어 아세틸콜린 수용체를 발현하는 근육세포가 신호를 받아 수축명령을 따르게 된다. 그러나 신경독소(Neurotoxin)인 보툴리눔 독소가 신경세포질로 유입된 후, 신경전달물질의 분비에 관련된 SNARE (Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor-attachment protein receptors) 단백질을 분해하여 아세틸콜린이 분비되지 못한 상태로 남아있게 되면 근수축이 일어나지 않고 이완된 상태가 유지되어 이완성 마비증상이 나타난다[3]. 의학적으로는 이러한 보툴리눔 독소의 특성을 이용해서 위에서 언급한 바와 같이, 주름살을 만드는 근육을 이완시키는 목적으로 극미량의 보툴리눔 독소를 사용하는데 그 대표적인 의약품이 “보톡스(BotoxⓇ)”이다. 혈청형 중에서 A형이 보톡스 제조에 사용되고 있다. 이러한 의약품은 미용적 치료뿐만 아니라 사시, 얼굴 떨림, 눈꺼풀 경련, 근강직 등의 치료에도 이용되고 있기 때문에 보툴리눔 독소는 의학적으로도 이용가치가 매우 높은 물질이다.

보툴리눔 독소증은 독소성분에 노출되는 경로에 따라 크게 4가지, 즉, 식품유래 보툴리눔 독소증(Food-borne botulism), 유아 보툴리눔 독소증(Infant botulism), 상처 보툴리눔 독소증(Wound botulism), 흡인형 보툴리눔 독소증(Inhalational botulism)으로 구분할 수 있다. 식품유래 보툴리눔 독소증은 대부분 저장식품의 살균이 부적절하여, 식품내부의 혐기상태에서 균이 증식하고 독소가 만들어지면서, 이 음식물을 섭취하였을 때 독소성분이 체내로 흡수되어 급성으로 발생한다. 유아 보툴리눔 독소증은 장내 정상 세균 총이 형성되지 않은 1세 미만의 영아들에게서 발병하는데, 꿀과 같은 음식물이나 카펫과 같은 생활환경에서 보툴리눔 포자에 노출되는 것이 그 원인으로 추정되고 있다. 상처 보툴리눔 독소증은 포자가 상처를 통해 감염되어 체내에서 독소가 생성됨으로써 중독증상이 나타나고, 헤로인과 같은 마약의 피하주사 후에 생긴 상처에 감염된 사례가 많이 보고되었다. 흡인형 보툴리눔 독소증은 자연발생 형태가 아니라 생물테러나 생물학전 같은 의도적인 살포에 의한 중독 형태이다. 실제로 1961년 독일의 한 실험실에서는 사고에 의해 보툴리눔 독소 A형의 흡인형 중독 사례가 보고된 적이 있다[5]. 전 세계적으로 식품유래, 유아, 상처 보툴리눔 독소증 사례가 지속적으로 보고되고 있다. 국내에서도 생물테러에 의한 보툴리눔 독소증 발생은 없었으나, 2003년, 2004년에 각각 식품유래 보툴리눔 독소증 양성환자가 확인된 사례가 있다. 두 경우의 환자 모두 회복하였으며, 독소형은 각각 A형과 B형으로 확인되었다. 보툴리눔 독소증의 주요 사망원인은 호흡근, 흉근 등의 마비 및 호흡기도 폐쇄로 인한 호흡장애이기 때문에, 1950년대 이전에는 치사율이 60%에 달했지만, 이후 의료시설 및 기술이 발달하면서 5% 미만으로 감소하였다.

보툴리눔 독소증에 대한 치료법으로는 불활성화한 보툴리눔 독소를 말에 주사한 후 생성된 항혈청을 정제하여 제조한, 마(馬) 항독소를 정맥주사하는 수동면역법이 널리 이용되고 있으나, 다량의 이종단백질이 투여되기 때문에 부작용이 발생할 수 있다. 미국에서는 마 항독소의 부작용을 줄이기 위해 개선된 형태의 항독소를 FDA허가 전단계인 IND(신의료물질)로 개발하였고, 총 4천 억원을 투입하여 현재 생물테러 대비용 항독소 200,000회 분량을 비축하고 있다. 항독소는 독소가 순환기계에 존재하고 아직 신경말단에 결합하지 않은 초기 단계에 투여하는 것이 가장 효과적이지만, 실제 환자는 마비증상이 발현된 후에 보툴리눔 독소증 진단을 받기 때문에, 증상발현 후 가능한 한 신속하게 항독소를 투여하는 것이 추가적인 신경마비를 방지할 수 있는 최선의 치료이다. 항독소는 혈중에 잔존하는 독소성분에 부착하여 중화시킴으로써, 추가적인 신경세포 손상을 방지하는 치료효과가 있기때문에, 이미 손상된 신경세포에 대한 당장의 회복효과는 기대할 수 없다. 손상된 신경세포의 말단부위가 서서히 재생되고 그에 따라 환자의 마비증상도 회복되는데, 항독소를 투여한 환자의 경우 신경세포손상이 적은 만큼 회복기간도 단축되는 것으로 보고되고 있다. 유아 보툴리눔 독소증의 치료를 위해서 미국에서는 사람유래 항독소(Baby BIG)를 사용하고 있고 이는 마혈청에 비해 부작용이 적다.

현재까지 보툴리눔 독소증의 예방백신으로 허가를 받은 의약품은 없으나, 미국에서는 A형과 B형 독소를 불활성화한 톡소이드 2가 백신이 2차 대전 당시 참전 군인에게 사용되었고, 1950년대 후반에 A, B, C, D, E 5가 톡소이드 백신으로 대체되어 IND로 미국 내 군인이나 연구 관련자 등 특정 그룹에 대해 제한적으로 사용되었다. 그러나 부작용 및 효능에 대한 문제가 제기되어 2013년부터 미국 CDC에서는 더 이상 톡소이드 백신의 접종을 권고하지 않는 것으로 알려져 있다. 일본에서도 연구 종사자를 위해 A, B, E, F 4가 백신이 개발되었다는 보고가 있었지만, 국내에서는 사용할 수 있는 의약품이 전무하므로 비상시를 대비한 예방백신 개발이 필요한 상황이다.

보툴리눔 독소증의 잠복기는 6시간에서 2주까지 다양하며, 이는 체내에 흡수되는 독소량에 의해 좌우된다. 식품유래 보툴리눔 독소증의 경우 음식내부에 이미 생성되어 있는 독소를 섭취하여 발병하므로 잠복기가 대략 12-36시간 정도로 짧지만 포자가 감염되어 발병하는 경우는 상대적으로 더 길다. 주요 임상증상은 시야가 흐려지고 상이 두개로 보이는 복시현상, 눈꺼풀이 처지는 증상(Drooping eyelid, Ptosis), 말투가 어눌해지는 증상(Slurred speech), 입안이 마르고 음식물을 삼키기 힘든 연하곤란 증상 등이 나타나면서 안면부부터 하지에 이르는 하행성 마비증상이 특징적이다(Figure 2). 그러나 발병초기에는 이러한 임상 특징들이 명확하지 않기 때문에 길랑-바레증후군(Guillain-Barré syndrome), 밀러-피셔증후군(Miller-Fisher Syndrome), 중증 근무력증(Myasthenia gravis) 등 다른 신경계 질환과 구별하기 위한 실험실 진단이 필요하다.

의심환자가 발생하는 경우, 관할보건소에 신고하여야 하고, 신속보고 체계에 따라 생물테러대응과로 일일보고가 이루어지고, 정확한 실험실 진단을 위해 환자가검물이 채취되어 질병관리본부 국립보건연구원으로 검체 접수가 이루어진다. 실험실 진단을 하기 위해서는 혈청, 분변, 관장액, 부종액, 위내용물 등의 임상가검물이 필요하다. 보툴리눔 독소증 진단 및 독소형 확인을 위한 국제적인 Gold standard 실험법은 마우스 검사법이다. 현재 실험실 진단 과정은 검체의 전처리, 마우스 검사(독성검사 및 중화능 검사), 보툴리눔 독소 확인을 위한 ELISA, 보툴리눔균 분리 동정을 위한 배양 및 유전자 검사법을 포함하고 있다.

마우스 검사(Mouse bioassay)는 검체와 특정 독소형에 대한 표준항독소를 각각 혼합하여 마우스에 주사하고 72시간 동안 관찰하면서, 독성이 발현되거나 표준항독소에 의해 중화되는지 여부를 관찰하는 시험방법이다. 만약 검체에 특정한 보툴리눔 독소가 포함되어 있다면 항독소를 처리하지 않은 실험군과 비특이적 항독소가 혼합된 실험군의 마우스는 모두 증상을 보이거나 치사할 것이다. 이에 비해, 특정 보툴리눔 독소를 중화시킬 수 있는 항독소가 혼합된 실험군의 마우스는 증상이 없거나 살아남을 것이므로 시험 검체내에 보툴리눔 독소의 포함여부와 그 독소형을 확인할 수 있다. 보툴리눔 독소가 포함된 검체를 접종한 마우스에서는 치사전 털이 곤두서고 허리부분이 조여 있고 호흡이 어려워지며 늑골마비 및 움직임이 둔해지는 증상이 관찰된다. 마우스 검사시, 마우스당 검체를 0.5ml이상 접종해야하므로 정확한 시험을 위해서는 임상 검체를 충분히 확보하는 것도 매우 중요하다.

또한 절대혐기성 세균의 특징을 이용하여 가검물 내에 존재하는 균 분리 및 균의 독소 생성 여부를 확인하기 위해 혐기배양을 한 후, 배양 상층액의 마우스 검사를 진행함으로써 독소 포함 여부를 확인한다. 확인된 보툴리눔균을 Egg yolk 배지에서 혐기배양 했을 때, 집락 형태는 다양하며 비스듬히 비추면 각도에 따라 다양한 색을 나타내는 진주빛 층(pearly layer)이 관찰된다.
마우스 검사는 보툴리눔 독소의 검출 및 독소형 확인을 위해 국제적으로 통용되고 있지만 동물윤리문제가 대두되면서 이를 대체할 수 있는 시험법 연구에 대한 수요가 증가하였다. 그 결과 수치상으로는 민감도나 신속성 측면에서 Table 1과 같이 마우스 검사법과 비교할만한 정도의 여러 가지 시험법이 개발되었다고 할 수 있지만, 다양한 독소형을 한 번에 진단할 수 없다는 점과 다양한 형태의 검체에 대한 적용의 한계성 등의 문제를 넘어서지 못하는 것이 사실이다[5, 6, 7].

생물테러가 의심되는 경우에는 공기포집물, 백색가루 등 미확인 가검물, 오염이 의심되는 토양 등의 환경 검체는 생물테러병원체 및 독소 다중탐지키트를 이용하여 보툴리눔 독소 A형의 포함여부를 확인할 수 있다. 다중탐지키트는 2004년 질병관리본부 국립보건연구원과 민간기업이 학술연구용역사업을 통해 개발하였고, 백색가루와 같은 환경검체에 포함되어있는 보툴리눔 독소, 탄저, 두창, 페스트, 야토, 브루셀라, 콜레라, SEB, 리신독소 등 9종의 병원체(세균, 바이러스) 및 독소를 한 번에 스크리닝 할 수 있다 (Figure 3).

개발이후 질병관리본부 생물테러대응과에서는 현장 진단용으로 2007년부터 매년 각 보건조직(보건소)에 다중탐지키트를 배포하여 현재까지 현장에서 사용하도록 하고 있다. 키트 내 포함된 보툴리눔 독소 A형의 검출한계는 50ng/ml이며, 의심 검체가 검출한계 이하의 독소를 포함할 수 있으므로 현장의 판단에 따라 의심되는 사항이 있으면 바로 검체를 질병관리본부 국립보건연구원으로 송부하여 확인시험 절차에 착수하도록 해야 한다. 질병리본부에서 발행한 “생물테러대응 실험실 네트워크: 등급 A, B 검사실 프로토콜”에 따라 보툴리눔 독소증 의심 검체 및 환자 가검물은 질병관리본부 국립보건연구원 병원체방어연구과에서 최종 확인진단을 수행하고 있다.

Ⅲ. 맺음말


  보툴리눔 독소는 현존하는 가장 치명적인 독소로 평상시에도 미국의 경우 매년 일백여명까지 환자가 발병하고 있을 뿐 아니라 여러 나라에서 이미 생물무기로까지 개발된 바 있다. 특히 보툴리눔 독소는 감염성 병원체 자체가 아닌 미량의 독소 단백질만으로도 치명적인 결과를 초래할 수 있기 때문에 테러범이 자신을 방어할 항독소나 백신을 개발할 기술이 없는 상태에서도 손쉽게 생물테러에 사용할 수 있어, 가난하고 기술력이 부족한 테러국이나 테러집단이 이를 생물테러에 악용할 가능성이 있다. 이러한 잠재적 위험요소 때문에 최근까지도 부작용을 줄인 항독소 개발 및 고감도 탐지키트의 연구개발이 이어지고 있다. 국내 및 국제 생물테러대응 실험실 네트워크를 통해 보툴리눔 독소에 의한 생물테러발생의 탐지 및 진단 체계를 강화하고, 부작용이 낮고 효능이 높은 치료제나 예방백신 개발에 대한 지속적인 투자와 연구를 진행하여 국가 생물테러대비·대응 능력을 강화해야 할 것이다.

Ⅳ. 참고 문헌


1. Ting PT, Freiman A. 2004. The story of Clostridium botulinum: from food poisoning to Botox. Clin Med. May-Jun;4(3):258-61.
2. Erbguth FJ. 2004. Historical notes on botulism, Clostridium botulinum, botulinum
toxin, and the idea of the therapeutic use of the toxin. Mov Disord. Mar;19 Suppl 8:S2-6.
3. Arnon SS, Schechter R, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, Fine AD, Hauer J, Layton M, Lillibridge S, Osterholm MT, O'Toole T, Parker G, Perl TM, Russell PK, Swerdlow DL, Tonat K. 2001. Working Group on Civilian Biodefense. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. Feb 28;285(8):1059-70.
4. Gu S, Rumpel S, Zhou J, Strotmeier J, Bigalke H, Perry K, Shoemaker CB, Rummel A, Jin R. 2012. Botulinum neurotoxin is shielded by NTNHA in an interlocked complex. Science. Feb 24;335(6071):977-81.
5. Dhaked RK, Singh MK, Singh P, Gupta P. 2010. Botulinum toxin: bioweapon &
magic drug. Indian J Med Res. Nov;132:489-503.
6. Bagramyan K, Barash JR, Arnon SS, Kalkum M. 2008. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. Apr 30;3(4):e2041.
7. Lindström M, Korkeala H. 2006. Laboratory diagnostics of botulism. Clin Microbiol Rev. Apr;19(2):298-314.