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제브라피쉬를 활용한 심뇌혈관질환 모델 개발
  • 작성일2014-10-30
  • 최종수정일2014-10-30
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7166
제브라피쉬를 활용한 심뇌혈관질환 모델 개발
Development of Vascular Disease Models in Zebrafish

질병관리본부 국립보건연구원 생명의과학센터 심혈관·희귀질환과
임현정, 문현이


Abstract


Zebrafish is a vertebrate that shares similarities in genomic information and organ systems with humans, and has become a popular model organism for studying developmental processes and differentiation as well as human diseases. Owing to the rapidly advancing genome editing technology of today, zebrafish is becoming one of the core experimental model systems to study various human diseases and to develop corresponding disease treatments. Currently, the field of studying human diseases using zebrafish includes, but not limited to, cardiovascular diseases, brain diseases, metabolic diseases, cancer, skin diseases and novel drug discovery. Disease modeling using zebrafish could be evolved into more powerful experimental systems that can reinforce the research on the feasible treatments for human diseases in the near future. Here, we summarize the value of zebrafish disease models and recent applications of the disease modeling by zebrafish in the cardiovascular and brain research field.



I. 들어가는 말


  실험동물모델의 활용은 사람에게서 발생하는 질환의 원인 및 병태생리 규명과 질환의 예방·진단 및 치료방법을 모색하는 수단으로 의생명과학 분야의 발전과 더불어 병행하여 왔다. 실험동물을 이용한 질환모델구축은 1980년대 후반부터 개발되기 시작하여 1990년대 후반부터는 기능유전체 연구와 사람의 질병모델을 생산하기 위한 목적으로 대규모 프로젝트들이 시도되었다. 지난 20년간 초파리, 예쁜꼬마선충, 제브라피쉬, 개구리, 마우스 등 다양한 동물이 질환모델로 활용되어 왔고 그 중에서도 설치류(마우스)가 기초중개 및 임상연구를 위한 대표적인 실험동물모델로서 사용되어 왔다. 하지만 마우스를 이용한 질환동물모델은 발생초기 질병의 표현형 관찰, 유전자의 고속기능분석 및 대규모 스크리닝의 어려움, 시간적․경제적 측면에서의 부담 등으로 질환모델개발과 유전자 기능연구에서 제한점을 가지고 있다. 또한 인간게놈 프로젝트 이후 공개된 새로운 유전자의 기능연구에 대한 새로운 동물모델의 필요성이 대두되면서 제브라피쉬를 활용한 질환모델 개발이 주목받기 시작했다. 척추동물의 발생기전연구와 유전자·유전체 기능연구에 탁월한 장점을 가지고 있는 제브라피쉬는 유전자 가위기술의 급속한 발전에 힘입어 생명과학 및 의학연구 분야에서 인간질환모델로 이용되고 있는 다수의 모델동물 중에서 두각을 나타내고 있다.
본 글에서는 제브라피쉬의 특성과 제브라피쉬를 활용한 심뇌혈관질환모델링 현황에 대해 간략히 소개하고자 한다.

II. 몸 말


  제브라피쉬는 열대에 서식하는 담수어로 성체의 크기는 3-4cm이며 수명은 약 2년 정도로 생후 3개월이면 번식이 가능하다. 좁은 공간에서 대량사육이 가능하며 유지비용이 마우스나 다른 설치류에 비해 수 십분의 1정도로 사육·관리가 경제적이다. 특히 발생기간이 짧아 수정 후 24시간이 지나면 뇌, 심장, 혈관 등 대부분의 주요 장기와 기관이 형성되고 배아가 투명하여 발생과정 관찰이 용이하다[1]. 또한 포유류와는 달리 체외 수정을 하며 일주일 간격으로 200-300개 정도의 수정란을 대량으로 쉽게 얻을 수 있기 때문에 유전자 조작이 용이하고 비교적 적은 비용으로 대규모 고속기능연구가 가능하다는 장점을 가진다. 척추동물로서 인간과 유전적으로 많은 공통점을 지니고 있으며 인간이 지니고 있는 대부분의 장기(심장, 간, 췌장, 신장, 흉선)를 지니고 있다.

제브라피쉬 게놈 시컨싱 프로젝트(Zebrafish genome-sequencing project) 결과, 질환관련 유전자를 포함하여 적어도 70%의 유전자가 인간과 동일하게 존재한다는 것이 보고되었고, 이러한 결과는 대부분 인간의 생리·병태현상이 제브라피쉬에서 모델화가 가능하다는 것을 의미한다[2]. 더욱이 최근 분자세포·생물학적 분석기술, 게놈 에디팅 기술, in vivo 실시간 이미징 기술 등 제브라피쉬 질환모델의 구축과 평가에 활용 가능한 기법 및 기술의 개선과 개발에 따라 대부분의 마우스실험기법이 제브라피쉬에서 가능하게 됨으로써 제브라피쉬를 활용한 질환모델은 꾸준히 새로운 연구영역들을 구축해나가고 있다. 지난 10여년 동안 질환모델에 이용된 실험동물종별 논문수를 살펴보면 제브라피쉬를 활용한 논문수가 2009년을 기점으로 매년 급격히 증가함을 보였고 이는 연구 분야에서 제브라피쉬 모델의 활용도가 증가하고 있음을 나타낸다(Figure 1)[3].

현재까지 보고된 많은 제브라피쉬 돌연변이체는 인간의 질환과 매우 유사함이 밝혀졌고 심혈관계, 근육계, 골형성, 신경계, 감각계, 생식계 등 인간에게 유발되는 거의 대부분의 질병분야 연구에 적용될 수 있다(Figure 2). 제브라피쉬는 혈액질환, 근육질환에서 퇴행성신경질환과 암에 이르기까지 다양한 인간질환에 대한 질환모델이 개발·연구되어왔고 신약개발연구 분야에 있어서도 small molecule 스크리닝을 통해 다양한 질환치료 물질 발굴, 대단위 약물 검증, 독성연구, 전 임상시험 등 신약개발 후보물질에 대한 독성평가 및 약효 평가에 대한 탁월한 이점을 가진 실험동물모델임이 이미 많은 연구자들에서 입증되고 있다(Figure 2)[4-5].

앞서도 언급했듯이 제브라피쉬의 경우 배아가 투명하고 손쉬운 유전자 조작으로 인해 조직별 관찰이 용이하고 이러한 장점은 조직 특이적 프로모터를 이용한 형질전환 제브라피쉬 구축을 통해 조직별 발생과정이나 표현형 관찰의 이미지화가 가능하다. 특별히 혈관 및 심장 특이적 프로모터를 가진 형질전환 제브라피쉬-Tg(flia1:GFP, kdr1:GFP, cmlc2:GFP)-들이 구축되어 있어 혈관과 심장발생 각 단계에서 육안으로 관찰이 가능하다(Figure 3D). 이들 개체는 혈관형성, 신생혈관억제, 체내 출혈현상, 심장박동, 부종, 혈전현상 등 심혈관계 모니터링을 통해 유전자 기능분석 및 질환 후보물질 발굴 등의 동물모델로 활용되고 있다.

심혈관질환모델인 제브라피쉬는 인간의 cardiac morphology와 cardiac cycle이 유사하고 발생초기에는 피부를 통한 수동적 호흡을 통해 산소와 영양분을 공급받음으로써 심각한 심장결손의 경우에도 모델동물로서 재현이 가능하다는 장점을 가진다. 또한 투명한 배아로 인해 초기 발생과정, 심장박동, 혈액의 흐름, 혈관발생 등을 현미경 하에서 다양한 형질전환 제브라피쉬(transgenic zebrafish)를 통해 쉽게 관찰할 수 있으며, 인간과 비교적 높은 상동성을 바탕으로 선천성 심장기형(congenital heart defects)을 비롯하여 부정맥(arrhythmia), 심근증(cardiomyopathy) 등의 심혈관계질환 모델을 제작하여 질환의 발생기전 및 치료제 후보물질의 대규모 스크리닝에 활용되고 있다(Table 1)[8]. 또한 제브라피쉬는 심장을 포함한 대부분의 기관에 탁월한 재생능력을 가지고 있어 성체 제브라피쉬의 경우 심장 손실 후 2개월 내에는 정상적인 심장으로 복구가 되기 때문에 이를 활용한 재생연구 및 줄기세포연구에서도 주목을 받고 있다.
선천성 심장기형모델(Congenital Heart Defects, CHD) 환자로부터 확인된 원인유전자 중 하나인 UGDH(UDP-glucose dehydrogenase)가 심장판막(cardiac valve) 형성에 중요한 기능을 한다는 것은 제브라피쉬를 통해서 최초로 밝혀졌으며, 제브라피쉬 ugdh 유전자 돌연변이체(jekyll mutant)에서는 AV-valve가 형성되지 않는 것을 관찰할 수 있다. 또한 환자에서만 특이적으로 발현하는 ALK2 L343P variant를 제브라피쉬에서 과발현한 결과 AV canal malformation을 보임으로써 사람에서 AVS defect과 유사한 특성을 보였다.
부정맥모델로 제브라피쉬 kcnh2 돌연변이체(breakdance mutant)에서는 사람에서와 동일한 type2 long QT syndrome 표현형이 관찰되며, 돌연변이체를 이용한 small molecule 스크리닝과 전기·생리학적 분석을 통해서 치료제물질을 확보할 수 있는 질환모델로 활용할 수 있다.

심근증모델은 제브라피쉬 돌연변이체와 cardiotoxic chemotherapy를 이용한 제브라피쉬 심근증모델로 인간의 heart failure과 유사한 표현형을 관찰할 수 있다. 대표적으로 troponin T 유전자의 돌연변이체인 ‘silent heart’는 sarcomere defect과 심근세포의 배열을 불규칙적으로 나타나며, 확장성 심근증이 관찰된다. 또한 항암치료제로 사용되는 doxorubicin은 cardiotoxicity를 가지고 있어 임상학적으로 심근증과 선천성 심장기형을 유발시킴으로써 질환모델을 제작하여 약물 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.

뇌신경질환모델로써 제브라피쉬 중추신경계는 척추동물과 매우 유사하며, spinal cord, hindbrain, midbrain, forebrain으로 구성되어 있다. Knock-down/out 및 과발현 기술을 이용한 제브라피쉬 신경퇴행성질환 모델(neurodegeneration models) 제작은 인간의 질환 발병기전을 이해하는 데 상당한 이점을 가지고 있다(Table 2)[9].
파킨슨병(Parkinson`s disease, PD)과 관련된 유전자인 parkin, pink1, dj-1, lrrk2의 제브라피쉬 상동유전자가 있으며, 유전자의 소실 및 과발현을 이용한 질환모델은 사람의 파킨슨병 표현형과 매우 유사하다. Parkin은 autosomal-recessive early-onset PD에서 대부분 변이되어 있는 유전자로, 제브라피쉬 발생 동안 전반적으로 발현하며, 발생배에서 parkin 유전자손실에 의해 dopaminergic neurons이 현저히 감소되는 것이 관찰된다.

알츠하이머병(Alzheimer`s disease, AD)는 매우 빈번한 뇌질환 중 하나로, presenilin(PS), tau(MAPT), amyloid-β precursor protein(APP) 유전자의 돌연변이와 관련이 있으며, 병리학적으로 amyloid-β(Aβ) protein이 포함된 plaque가 형성되고, 신경섬유 변성(neurofibrillary tangle)이 관찰된다. 형질전환 및 morpholino를 이용한 제브라피쉬 AD모델은 AD 발병기전을 연구하고, 치료제 개발에 있어 대량의 화합물 스크리닝에 유용한 모델동물로 활용가능하다.

간질(Epilesy)
은 전 세계적으로 약 7천만 명 정도가 보고된 매우 복잡한 neurological disorder로 다양한 유전적·환경적 요인들이 작용한다고 알려져 있지만, 현재까지 명확한 생리·병리학적인 기전이 밝혀져 있지 않다. 기존에 설치류(mouse, rat)를 이용한 간질모델은 대규모 유전적 분석 및 치료제 스크리닝에 한계점을 보이기 때문에 최근 제브라피쉬를 이용한 간질연구가 활발히 진행되고 있다. 제브라피쉬에 간질발작유도제, PTZ(Pentylenetetrazol)를 처리하면 대조군과는 달리 PTZ를 처리한 제브라피쉬에서 비정상적인 움직임이 많아지고, 소용돌이처럼 회전을 하거나 전신에 발작을 보이는 등 설치류를 이용한 간질모델에서 보였던 다양한 행동학적 변화가 관찰된다. 이러한 제브라피쉬 간질모델은 대규모의 간질치료제 초고속 스크리닝에 강력한 수단으로 활용될 수 있으며, 병리기전을 이해하는 데 많은 도움이 될 것으로 사료된다[10-11].

III. 맺는 말


  인간의 질병을 극복하기 위한 기초·응용연구와 임상연구 분야에서 다양한 모델동물이 시도되고 있으며, 인간의 질병과 유사한 최적의 모델동물을 선정· 활용하는 것은 연구를 진행함에 있어 매우 중요한 부분이다. 따라서 본 글에서는 질환연구모델로서 제브라피쉬의 장점과 개발된 심혈관질환 및 뇌신경질환모델을 통해 활용분야를 살펴보았다. 단일 모델동물에 의한 인간질환모델의 완벽한 재현은 어렵고 제브라피쉬 질환모델의 경우도 모델동물로서의 제한점을 가지는 것은 사실이다. 하지만 제브라피쉬가 인간질환을 모델링하는데 있어 편리하고 강력한 플랫폼을 제공함으로써 유전자·유전체 기능연구, 질병의 새로운 표적발굴, 초고속 스크리닝, 심뇌혈관 이미징 연구 등에 매우 이상적인 모델동물임은 틀림없어 보인다. 또한 인간과의 높은 상동성, 유전학적, 병리학적 측면에서의 유사성, 질환모델 분석기술의 발달, 유전자조작기술의 발전으로 인해 제브라피쉬의 질환모델개발과 활용도는 점점 증가될 것이다. 이들 제브라피쉬를 활용한 질환모델의 개발은 심뇌혈관질환 뿐만 아니라 다양한 질환의 병태를 이해하고 질환치료기술 개발연구에 기여할 것으로 기대된다.

IV. 참고문헌


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11. Stewart AM1, Braubach O2, Spitsbergen J3, Gerlai R4, Kalueff AV. 2014. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside, Trends Neurosci, 37(5):264-78.
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