Abstract
Background: Vibrio parahaemolyticus is one of the leading causes of food-borne outbreaks and acute gastroenteritis worldwide. The genetic structure of V. parahaemolyticus isolates spreading in Korea remains undefined.
Methodology: In this study, 94 clinical isolates were used to examine the genetic relationship and diversity in Korea during 3 years (2013-2015). Multilocus sequence typing (MLST) method was used to study prevalence and clonal structure of clinical isolated strains. PCR conditions of the seven house keeping genes and sequence types(ST) designation of all isolates were followed as described in pubMLST. A real-time PCR assay was performed to determine the presence of tdh and trh gene. Genetic diversity analysis were carried out using the MEGA 6 software. Based on the related STs, the isolates were subdivided into clonal complex(CC) or groups by goeBURST analysis using PHYLOViZ software.
Results: The 94 tested isolates fell into 11 STs, of which two STs were new to the MLST database. The prevalence of STs was ST-3(38.3%), ST-332(28.7%), ST-8(16.0%), ST-50(7.4%), ST-610(2.1%), 624(2.1%) and the rest of the STs were represented by a single strain. ST-3 was the only ST with an international distribution. The nucleotide diversity ranged from 0.010 (gyrB) to 0.026(dtdS) and recA presented the largest number of variable sites (6.0%, 44/729). goeBURST algorithm analysis showed that tested strains were not so much related to each other, 66 STs out of V. parahaemolyticus pubMLST databaes were formed 5 CCs, 3 groups, and 3 singletons with our 11 STs.
Conclusion: 11 STs were not clustered by region distributions in Korea, but formed 5 CCs, 3 groups, and 3 singletons with pubMLST database. From these, genetic structure of V. parahaemolyticus in Korea seem to not so much different to other countries, suggesting genetic diversity.
Key Words: Vibrio parahaemolyticus, Multi Locus Sequence Typing (MLST)


Ⅰ. 들어가는말

장염 비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)은 호염성 세균으로 운동성이 있는 그람음성 간균이며, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 등과 함께 해안지역에 광범위하게 분포되어 있다[1]. 또한 대표적인 세균성 식중독의 원인균으로 굴, 조개 등과 같은 패류 및 연안에서 서식하는 각종 해조류를 섭식한 사람에게 흔히 급성 위장염을 일으킨다[2]. 해수온도가 15°C 이상으로 상승하는 초여름부터 활발하게 증식하며, 이에 따라 여름부터 늦가을까지 해양 생태계 내에서 균 밀도가 가장 높다[3]. 알려진 병원성 요소 가운데 장염을 유발하는데 특히 중요한 것은 장독소(enterotoxin)를 생성하는 내열성 용혈독소(tdh; thermostable direct hemolysin)이며[4], 이것과 70% 이상의 유전자 염기서열 유사성을 보이는 trh (tdh-related hemolysin)가 있다[5].
본 연구에서는 급성설사질환 실험실 감시사업(EnterNet-Korea)을 통해 국내 각 지역 환자로부터 분리된 장염 비브리오균을 대상으로 유전적 연관성을 확인하고자 분자생물학적 분석법인 MLST (Multilocus sequence typing)를 수행하였다. 또한 국내 임상 분리주의 유전자 유형과 독소 유전자 보유 여부를 파악하여 집단 식중독 대비와 전파 여부 등의 규명을 위한 기초 자료로 제공하고자 하였다.


Ⅱ. 몸 말

연구에 사용된 균주는 3년간(2013-2015년) 급성설사질환 실험실 감시사업(엔터넷)을 통해 설사 질환 환자로부터 분리된 94주의 장염 비브리오균을 대상으로 하였다. 환자의 대변 또는 직장도말을 검체로 하여 TCBS (Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar)와 BCVM (Bio-chrome Vibrio medium) 선택배지에 접종하여, 각각 짙은 녹색과 옅은 보라색을 나타내는 집락을 선별하였다[6]. API20E kit를 이용한 생화학적 검사와, 종합효소연쇄중합반응(PCR)으로 종 특이 유전자(toxR)와 독소유전자(tdh, trh) 보유 여부를 확인하는 분자생물학적 검사를 통하여 장염 비브리오균을 분리, 동정하였다.
다양한 분자생물학적 분석법 중 MLST는 전 세계가 동일한 실험법으로 분석하여 분리균주들의 ST (Sequence type)과 CC (Clonal complex) 정보를 공유할 수 있어 균종들의 역학적 기원 및 진화적 배경들을 추정할 수 있는 장점이 있다. 장염 비브리오균 MLST 실험법은 pubMLST 웹사이트 (http://www.pubmlst.org/parahaemolyticus)에 제시된 방법에 따라 7개의 house-keeping 유전자 recA, gyrB, dnaE (Chromosome Ⅰ), dtdS, pyrC, pntA, tnaA (Chromosome Ⅱ)를 PCR로 증폭하고 염기서열을 분석하였다[7]. pubMLST 데이터베이스(DB)에서 확인되지 않은 새로운 유전자 염기서열에 대해서는 새로이 등록하였고(dtdS-396, dtdS-397, tnaA-245), 새로운 ST은 균주에 대한 관련정보와 함께 DB에 등록하였다(ST-1530, ST-1531).
MLST 유전자별로 염기서열을 분석한 결과, 각 allele는 8-10가지 타입을 나타냈으며, Variable site의 수는 18-44개 범위였다(Table 1). 가장 많은 Variable site를 가진 유전자는 Chromosome Ⅰ과 Chromosome Ⅱ에서 각각 729 bp 중 44개의 염기서열이 다른 recA와 458 bp 중 26개의 염기서열이 다른 dtdS였다. Nucleotide diversity도 마찬가지로 recA와 dtdS 유전자가 각각 0.026, 0.025로 다른 유전자들에 비해 높은 값을 보였다.

MLST 분석 결과, 국내 장염비브리오균 94주는 11개의 ST로 확인되었으며, 이 중 두 개는 새로운 ST이었다(Table 2). 가장 높은 빈도를 나타낸 유형은 ST-3으로 분리균주 중 36주(34.6%)를 포함하였다. 그 다음으로 ST-332(27주, 26%), ST-8(15주, 14.4%), ST-50(7주, 6.7%) 순이었으며, 나머지 7개 ST은 5% 미만이었다. CC는 국내 임상 분리주 96주 중 86주를 포함하는 5개의 ST이 CC-3, CC-8, CC-50, CC-114, CC-332에 속하였다. 한편, 독소 유전자 분석결과, 국내 임상 분리 균주 중 96.8%(93/96주)가 tdh 또는 trh 유전자를 보유하고 있었다. ST-50과 ST-624는 tdh와 trh 유전자를 모두 보유하였으며, ST-114와 새로운 유형인 ST-1530, ST-1531은 두 독소 유전자에 모두 음성을 나타냈다.

ST간의 연관성을 살펴보기 위해 goeBURST 알고리즘(http://goeburst.phyloviz.net)을 이용하였다. 7개의 유전자 중 1개의 유전자 번호만 다른 SLV (single locus varient)를 가장 많이 가진 ST을 ancestral ST(조상 유형)이라 하며, ancestral ST이 존재하는 group을 CC라고 정의하였다[8]. 국내 장염 비브리오균이 나타낸 11개의 ST 간에는 서로 상관관계가 매우 낮아, 2016년 8월 기준 V. parahaemolyticus pubMLST에 등록되어 있는 1,531개의 ST과 함께 PHYLOViZ 프로그램을 이용하여 그 관계를 도식화하였다. 이를 통해 1,531개의 ST중 국내 11개 ST과 연관된 66개의 ST을 알아낼 수 있었으며, 연관된 ST을 포함한 77개의 ST은 5개의 CCs, 3개의 groups, 3개의 singletons으로 나뉘었다(Figure 1). 또한 ST-3, ST-8, ST-50, ST-114, ST-332은 각 CC의 ancestral ST이었다. 특히 국내 임상 분리주 중 가장 높은 빈도를 보인 ST-3이 ancestral ST인 CC-3에는 1966년 동남아시아에서 발생한 혈청형 O3:K6을 비롯해서 전 세계적인 장염 비브리오균 범유행의 주요한 원인균을 포함하고 있다[9].


Ⅲ. 맺는말

본 연구에서는 국내 설사질환 환자에서 분리된 V. parahaemolyticus에 대한 MLST 분석을 통해 국내 임상 분리주의 유전자 유형을 파악하고자 하였다. MLST 균주유형은 ST-3, ST-332, ST-8등 11개 ST으로, 이 11개 ST의 서로간의 연관성은 없어 국내 분리 V. parahaemolyticus가 유전적으로 다양함을 알 수 있었다. 이중 ST-3의 경우 전 세계적으로 분리되는 보편적인 유형이지만, ST-332는 중국에서만 보고되었던 유전형이며, ST-1530과 ST-1531은 우리나라에서만 확인된 유전형이다. 또한 ST-3, ST-8, ST-50, ST-114, ST-332는 CC를 형성하는 ancestral ST이었다. 이러한 장염비브리오균의 MLST 유전형 정보는 집단 환자 발생 시 원인 추적을 위한 역학조사 자료로 활용 가치가 높다고 할 수 있다. 아울러 지속적인 모니터링을 통해 축적된 자료는 향후 장염비브리오균의 특성 변화를 관찰할 수 있는 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Colwell R. R., Kaper J., Joseph S. W. 1977. Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and other vibrios: occurrence and distribution in Chesapeake Bay. Science 198: 374-396
2. Pal D., Das N. 2010. Isolation, identification and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus from fish samples in Kolkata. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 14: 545-549.
3. 나혜영, 홍사현, 정경태. 2016. 2013-2015년 국내 해양환경 분리 병원성 비브리오균의 분포와 환경인자와의 연관성 분석. 주간 건강과 질병. 제9권 제 9호.
4. Sakurai J., Matsuzaki A., Takeda Y., Miwatani T. 1974. Existence of two distinct hemolysins in Vibrio parahaemolyticus. Infect Immun. 9: 777-780.
5. Honda T., Ni Y. X., Miwatani T. 19 88. Purification and characterization of a hemolysin produced by a clinical isolate of Kanagawa phenomenon-negative Vibrio parahaemolyticus and related to the termostable direct hemolysin. Infect immun. 56: 961-965.
6. Hara-Kudo Y., Nishina T., Nakagawa H., Konuma H., Hasegawa J., Kumagai S. 2001. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Am Soc Microbiol. 67: 5819-5823
7. Gonzalez-Escalona N., Martinez-Urtaza J., Romero J., Espejo R. T., Jaykus L. A., Depaola A. 2008. Determination of molecular phylogenetics of Vibrio parahaemolyticus strains by multilocus sequence typing. J bacteriol. 190: 2831-2840
8. Francisco A. P., Vaz C., Monteiro P. T., Melo-Cristino J., Ramirez M., Carrico J. A. 2012. PHYLOVIZ:phylogenetic inference and data visualization for sequence based typing methods. BMC Bioinformatics. 13:87
9. Matsumoto C., Okuda J., Ishibashi M., Iwanaga M., Garg P, Rammamurthy T, Wong H. C, Depaola A, Kim Y. B, Albert M. J, Nishibuchi M. 2000. Pandemic spread of an O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus and emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and tosRS sequence analyses. J Clin Microbiol. 38: 578-585.