세브란스병원 진단검사의학과
김도균, 정석훈, 이경원*
질병관리본부 국립보건연구원 병원체자원관리 TF
정향민, 황규잠†
*교신저자 leekcp@yuhs.ac, 02-2228-2240
†공동교신저자 kyuhwang@nih.go.kr, 043-719-6870

Characterized Bacteria Resources from Clinical Specimen in Korea, 2014-2016
Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, Yonsei University
Kim Dokyun, Jeong Seok Hoon, Lee Kyungwon
Pathogen Resource TF, Center for Infectious Disease, NIH, CDC
Chung Hyangmin, Hwang Kyu Jam

Background: The pathogen resources bank for the clinical isolates became an important issue especially after the Nagoya Protocol in 2014. However, the previous system for the bacterium-banking process had limitations including lack of detailed information about the species identification, minimal inhibitory concentration, and mode of resistance. We isolated, characterized, and deposited clinical isolates from the National Culture Collection for Pathogens (NCCP) from 2014 to 2016.

Methodology: Survey about the stock and demand of the reference strains was given to the experts of the Korean Society of Clinical Microbiology. Referring to the result of the survey, we collected useful or rare clinical isolates in the tertiary hospitals from 2014 to 2016. The collected isolates were characterized in terms of identification, phenotype and genotype of resistance and toxin, and strain type.

Results: We have deposited 416 strains in the bank to characterize bacteria resources. A total of 193 strains were allotted for species identification, 40 strains for antimicrobial susceptibility testing, 14 strains for toxin gene testing, 169 strains for research of epidemiology and mode of resistance. These strains would expand the resources of the National Culture Collection for Pathogen and would also be useful for future medical research and the development of identification devices.



들어가는 말

임상 미생물 검사실 및 미생물 연구소에서는 정도관리, 교육, 연구 등의 목적에 사용되는 참조 균주가 중요하다. 특히 2014년에는 제 10차 생물다양성협약에서 법적 구속력이 있는 ‘유전자원 접근 및 이익 공유에 대한 나고야 의정서’의 발효로 인하여 병원체 자원에 대한 국가 주권이 중요한 이슈로 부각되었다. 또한, 항균제 내성은 국내·외에서 지속적으로 증가하고 있으며[1-3], 내성과 관련된 참조균주에 대한 수요도 점점 늘어나고 있다. 그람양성세균의 methicillin 내성과 vancomycin 내성, 그람음성세균의 extended-spectrum β-lactamase와 carbapenemase에 의한 3, 4세대 cephalosporin과 carbapenem 내성 등은 특히 중요하여, 최근 WHO에서도 감시체계를 확립하고 관리를 시작하는 등 전 세계적인 이슈로 자리잡고 있다[4]. 국내에서도 병원체에 대한 자원화 필요성을 인식하여 질병관리본부에서 운영 중인 국가병원체자원은행 (National Culture Collection for Pathogens, NCCP)은 병원체자원 네트워크를 구축하여 국내 임상분리 병원체를 수집, 자원화하고, 관리 및 분양하여 보건의료연구개발의 활성화에 기여하고 있다. 국가병원체자원은행의 분양 가능한 보유자원은 2014년 537종 2,063주 대비 2016년 588종 2,428주로 수집 및 자원화 건수가 17.7 % 증가하였다. 그러나 국외 자원은행들의 보유균수와는 많은 차이가 있어 지속적으로 다양한 병원체자원의 수집 및 특성분석의 확대가 요구되고 있다. 본 내용은 임상미생물관련 학회전문가들을 대상으로 참조균주의 보유현황과 수요를 조사한 후, 그에 맞는 임상균주를 수집하고, 각 균주의 특성화 분석결과에 관한 내용이다.


몸말

저자들은 정도관리용 및 교육용 균주의 수요 및 참조 균주 혹은 교육용 균주의 보유 현황과 수요를 파악하기 위해 관련 학회의 전문가들을 대상으로 설문을 시행하였다. 설문조사의 결과를 토대로, 2014년부터 2016년까지 총 3년간 종합병원에서 분리된 세균성 임상 분리주를 대상으로 1차 년도에는 그람음성막대균 특성화 및 자원화, 2차 년도에는 그람양성알균 특성화 및 자원화, 3차 년도에는 무산소성 균과 기타 임상분리주의 특성화 및 자원화를 진행하였고, 정도관리 균주 선별 시스템을 구축하였다. 참조균주는 사용 목적에 따라, 동정용, 항균제 감수성 시험용, 내성기전 시험용, 독소 시험용 및 감염 역학 시험용으로 구분하였으며, 그 용도에 따라 특성화 분석을 진행하였다. 연구기간 내에 개발할 참조균주의 목표 균주 수는 총 380주이며, 이 중 60주의 NCCP 등록을 목표로 하였다.
그람음성 막대균의 특성 분석에는 16S rRNA 또는 rpoB gene 염기서열 분석을 통한 정확한 균 동정, 디스크 확산법 및 한천희석법을 통한 항생제 내성 표현형 분석, carbapenemase 유전형 분석, ESBL 유전형 분석, aminoglycoside 수식효소 유전형 분석, 독소 유전자 유전형 분석, multilocus sequence typing (MLST)을 이용한 strain type 분석 등이 포함된다. 그람양성알균의 경우 디스크 확산법 및 한천희석법을 통한 항생제 내성 표현형 분석, mecA, vanA, vanB 등의 주요 내성 유전자 검출, 독소 유전자 검출, MLST를 이용한 strain type 분석 등이 포함되었다. Clostridium difficile의 경우 균종동정 및 독소 유전자 및 조절 유전자의 검출 (tcdC, tcdD, tcdE, binary toxin 생성유전자) 등을 검출하고 PCR ribotyping을 시행하였다.
참조균주 보유 및 수요에 대한 설문조사에 참여한 기관은 총 77개 기관으로, 53개의 종합병원, 11개의 연구기관, 5개의 수탁검사실 등이 포함되었다. 균종별 참조균주 보유 및 필요 수 조사에서 대부분의 기관에서 흔한 세균의 wild type을 보유하고 있었으나, 균종이 다양하지 못하며, ESBL, carbapenemase, 독소 등 특성분석이 된 참조균주는 대부분 보유하지 않고 있고 필요기관의 수가 많아 특성화 분석이 된 많은 균주들이 NCCP에 등록이 된다면 그 수요는 적지 않을 것으로 판단되었다.
설문 조사 결과를 바탕으로 2014년부터 2016년까지 총 416주 (1년차 144주, 2년차 135주, 3년차 137주)를 수집하여 특성 분석을 시행하였다. 균주의 용도별 분류는 균종동정용이 193주, 항균제 감수성 시험용이 40주, 독소유전자 시험용이 14주, 역학조사용이 18주, 내성기전 조사용이 33주, 내성기전 및 역학조사용이 118주였다 (Table 1). 균종 동정용으로 분리된 193주의 구성은 임상적으로 흔히 분리되는 그람양성세균인 Staphylococcus 균속 12주, Streptococcus 균속 12주, Enterococcus 균속 15주, 및 그람음성세균인 Pseudomonas 균속 15주, Acinsetobacter 균속이 19주, 혐기성세균인 Bacteroides 균속 14주와 그람양성 및 음성세균의 희귀 균주 각각 15주 및 51주 등이 포함되었다(Table 2, Table 3과 Table 4.). 항균제 감수성 시험용 참조균주 40주 중 18주는 디스크 확산법 시험에 사용할 수 있는 참조균주이며, 균주별로 디스크 확산법 시험 50s회를 반복하여 참조범위를 설정하였다(평균값 ± 2SD) (Table5). 독소 유전자용 참조균주는 bft-1, bft-2 그리고 bft-3를 독소 유전자를 가지고 있는 Bacteroides fragilis와 sea, sec, seg, seh, sei, tst 등의 독소 유전자를 가진 Staphylococcus aureus를 포함하였다. 역학 조사용 참조균주는 Clostridium difficile 중 임상적으로 중요한 ribotype인 159, 106, 078, 027, 084, 085, 010를 포함하는 14균주와 다제 내성과 연관된 sequence type (ST) 1249, 454, 701, 739의 Acinetobacter baumannii를 포함하였다. 내성기전 시험용 참조균주는 그람양성세균에서 vancomycin 내성과 관련된 vanA 유전자와 그람음성세균에서 중요한 내성과 연관된 ESBL 유전자와 carbapenemase 유전자을 가진 33주를 분석하여 기탁하였다. 그리고 내성기전 및 역학조사용 참조균주로 118주를 확보하였는데 균종별로는 A. baumannii 59주, P. aeruginosa 32주, E. coli 10주, K. pneumoniae 4주 및 E. faecium이 13주였다. A. baumannii 일부는 PCR mapping으로 OXA-23 유전자를 지닌 transposon을 규명하였고, colistin 내성 A. baumannii는 pmrCAB 유전자 및 LPS 유전자의 염기서열을 분석하였다. P. aeruginosa 일부는 전 유전체 염기서열 분석(whole genome sequencing, WGS)으로 carbapenemase 유전자를 지닌 genomic island (PAGI)를 규명하였다. K. pneumoniae 일부는 WGS로 KPC 유전자를 지닌 plasmid를 규명하였고, Enterococci 일부는 vanA operon과 plasmid 구조를 규명하였다(Data not shown).
세균의 항균제 내성은 계속 확산되고 있으며, 특히 그람음성세균에서는 내성기전의 확산이 clone에 의한 경우가 많다. OXA-23을 생성하는 A. baumannii CC92, metallo-β-lactamase 생성 Pseudomonas aeruginosa ST235, CTX-M-15 ESBL 생성 E. coli ST131 등이 대표적인 예이다. 그리고 이들 유행 내성 clone은 계속 바뀌는 경향이 있어 그 특성을 분석하여 자원은행에 자원화 하는 노력이 필요하다. 본 연구는 특성이 분석된 균주를 NCCP에 공급하여 NCCP의 자원을 확대하고 수요에 맞는 균주를 갖추는 것을 목표로 진행하였다. 균종 동정용으로 분석된 193주는 임상적으로 중요한 균종이거나, 분리가 드문 균종이 포함되었으며, 앞으로 matrix-associated laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)의 동정용 database 구축에도 유용할 것으로 생각된다. 항균제 감수성 시험용 참조균주 역시 임상 미생물 검사실에서 항균제감수성 내부정도관리용으로 그 유용성이 클 것으로 예상되며, 독소유전자 시험용, 역학조사용, 내성기전조사용으로 분석된 균주들 역시 각각의 시험에서 양성 참조균주로 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.


맺음 말

임상 미생물 검사실 및 교육기관에서 참조 균주에 대한 수요는 많이 증가하였지만, 특성이 분석된 세균 자원은행은 부족한 상황이다. 본 연구를 통하여 기탁된 총 416주는 NCCP 병원체 자원의 확대에 일조하였다고 여겨진다. 뿐만 아니라 지속적으로 늘어나고 있는 항균제 내성에 대비하기 위해서 이와 관련된 참조균주 역시 필요성이 점점 증가하고 있어, 앞으로 내성기전과 관련된 병원체균주를 지속적으로 확보하고 자원화 할 수 있는 기반을 마련하는 것이 필요할 것이다.


참고문헌

1. Hong SG, Yong D, Lee K, Kim EC, Lee WK, Jeong SH, et al. Antimicrobial resistance of clinically important bacteria isolated from hospitals located in representative provinces of Korea. Korean J Clin Microbiol 2003;6:29-36.
2. Lee K, Lee MA, Lee CH, Lee J, Roh KH, Kim S, et al. Increase of ceftazidime- and fluoroquinolone-resistant Klebsiella pneumoniae and imipenem-resistant Acinetobacter spp. in Korea: analysis of KONSAR study data from 2005 and 2007. Yonsei Med J 2010;51:901-11.
3. Shibayama K, Lee H, Kim S. Comparison of antibiotic resistance rate of medically important microorganisms between Japan and Korea. Ann Clin Microbiol 2015;18:111-8.
4. World Health Organization; Global Antimicrobial Resistance Surveillance System.(http://www.who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/surveillance/glass/en/)
5. Ha J, Kim KH, Kim JO, Hong J, Jeong SH and Lee K. Bacteraemia caused by Kytococcus schroeteri in a pneumonia patient. J Med Microb Diagn 2015;4:4.
6. Kim D, Hong SK, Seo YH, Kim MS, Kim HS, Yong D, et al. Two non-otic cases of POM-1 metallo-β-lactamase-producing Pseudomonas otitidis infection: Necrotizing fasciitis and pan-peritonitis.J Glob Antimicrob Resist. 2016;7:157-158.
7. Kwon SS, Kim JO, Kim KH, Jeong SH and Lee K. Persistent Bordetella petrii infection related to bone fractures. Ann Lab Med. 2016;36:70-72.
8. Kim DK, Hong SK, Kim M, Ahn JY, Yong D and Lee K. Campylobacter hyointestinalis isolated from a human stool specimen. Ann Lab Med. 2015;35:657-659.
9. Lee Y, Kim HS, Yong D, Jeong SH, Lee K and Chong Y. Bacteroides faecis and Bacteroides intestinalis recovered from clinical specimens of human intestinal origin. Yonsei Med J. 2015;56:292-4.



※ 이 글은 2014～2016년 질병관리본부 용역과제인 “특성화 세균자원은행” 결과보고서를 일부 요약 정리한 내용입니다.