Analysis of metabolic biomarkers for Type 2 diabetes (T2D) can shed insight into etiological pathways and improve the prediction of disease risk. Here, we aimed to identify serum metabolites as potentially informative biomarkers for T2D. We quantified the production of 123 metabolites from 2,240 subjects in the Korea Association Resource (KARE) cohort. Four metabolites, hexadecanoylcarnitine (C16), glycine, lysophosphatidylcholine acyl C18:2 (lysoPC a C18:2), and phosphatidylcholine acyl-alkyl C36:0 (PC ae C36:0), were significantly altered in T2D compared to non-T2D subjects, with P value < 4.07E-04 (after Bonferroni’s correction for multiple testing, α = 0.05). Among them, C16, glycine, and lysoPC a C18:2 were independently replicated in the population-based Cooperative Health Research in the Region of Augsburg (KORA) cohort. In addition, by combining a genome wide association study (GWAS) with metabolomics, alterations of these metabolites were associated with 10 genetic loci including six that were previously implicated in T2D or obesity. These results may help in developing novel strategies for preventing T2D in the Korean population.


I. 들어가는 말

제2형 당뇨는 발병률이 매우 높은 만성질환 중 하나로, 국제보건기구(WHO) 보고에 따르면, 2014년 기준 제2형 당뇨 확진 환자는 전 세계적으로 3억8백만명 정도이고, 2030년경에는 사망원인 7위에 도달할 것으로 예상되며, 대부분의 국가에서 치료비용에 대한 개인 및 사회적 차원의 막대한 경제 부담이 가중될 전망이다. 장기간의 잘못된 식습관과 생활습관으로 촉발되는 것으로 알려진 제2형 당뇨는 전체 당뇨 환자의 약 90%를 차지하고 있으며, 인슐린 비 의존성 당뇨 또는 성인 당뇨로 알려져 있다. 1980년대 들어 제2형 당뇨의 유전적 원인을 밝히고자 가계도 분석을 통한 유전 요인 규명이 시도 되었으며, 1990년대 들어 성인 발병 당뇨병(maturity-onset diabetes of the young, MODY)을 통해 28개 유전자 돌연변이들이 제 2형 당뇨에서 인슐린 결핍이나 인슐린 저항성을 유발한다는 것을 규명하였으며, 이것은 전체 당뇨 원인의 약 5%에 대해 설명을 가능하게 하였다(Figure 1A). 2000년 후반부터, 전장유전체연관분석(Genome wide association study, GWAS)를 통해 제2형 당뇨 위험과 연관성이 있는 것으로 보이는 유전 변이(SNPs)를 근거로 92개의 당뇨 감수성 유전자(T2D-susceptibility gene)가 보고되었다(Figure 1B). 최근 들어, 차세대염기서열분석(Next generation sequencing, NGS)을 이용한 타겟 시퀀싱을 통해 이들 중 일부 유전자(HK1, MTNR1B, PPARG, SLC30A8, 그리고 HNF1A)상의 유전변이와 연관 불균형 관계 블록(Linkage disequilibrium block, LD block)에 존재하는 기능 상실 변이(loss-of-function variants)가 제2형 당뇨의 원인이라고 확인 되었으며, 에피 유전체 연구를 통해 일부 유전자(TCF7L2, ZFAND3,CDKN2A, C2CD4A, C2CD4B, SLC30A8, 그리고 DGKB)상의 유전변이가 다른 유전자의 비정상적 전사활성조절과 관련되어 췌장 도세포(pancreatic islet)나 베타세포(beta cell)의 기능 억제를 촉진하여 제2형 당뇨를 유발 한다는 것이 보고되었다. 그럼에도 불구하고, 여전히 제2형 당뇨와 연관된 유전변이의 기능을 밝히는 연구가 필요하며, 유전자의 조절과 환경과의 상호작용에 대한 연구의 중요성이 높아가고 있는 상황이다.

대사체학(Metabolomics)은 생체내 저분자인 대사산물(metabolites)을 체내 수치와 질병과 같은 다양한 표현형 간의 관련성을 포괄적으로 해석하여, 표현형 결정에 중요한 영향을 미치는 생물학적 기전과 원인을 총체적으로 연구하는 생물학의 한 분야이다. 특히, 대사체는 시료 수집 순간까지 발생된 생체내 생화학적 변화 과정에 대한 다양한 정보를 반영하기 때문에 유전체로부터 입력된 정보와 변화무쌍한 환경적 영향에 의해 나타나는 기능적 표현형을 대변할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 대사체와 유전체의 통합 분석을 통해 유전변이에 대한 기능적 증거(functional evidence) 제시가 가능하고, 이를 통해 제2형 당뇨의 병리생리학적 기전이나 질병을 이해하는데 유용한 정보를 획득할 수 있다.
이 글에서는 질병관리본부 국립보건연구원 유전체센터의 유전체연구과에서 최근 수행한 한국인 지역사회기반 코호트로 부터 발굴된 제2형 당뇨 연관 대사체 마커, 그리고 이들 마커와 연관된 유전변이에 대한 분석 결과에 대해 기술하고자 한다.


II. 몸 말

지역사회 코호트로부터 제2형 당뇨 대사체 마커 발굴
2000년대 중반 이후 최첨단 극미량 질량분석기기의 기술적 발전과 통계분석 수준의 향상으로 대용량 대사체 분석(High-throughput metabolomics analysis)이 가능하게 되었고, 비표적화(Non-targeted) 또는 표적화(Targeted) 방법의 대사체 프로파일링을 통해 질병관련 마커 발굴이 가능하게 되었다[２]. 서양인에서 제2형 당뇨와 관련된 대사체 마커로는 leucine, isoleucine, valine과 같은 분지쇄 아미노산 (Branched chain amino acids, BCAAs), phenylalanine, tyrosine, tryptophan과 같은 방향족 아미노산 (aromatic amino acids, AAAs), 그리고 phospholipids, sphingomyelins, triglycerides, palmitate, palmitoleate와 같은 지질들이 잘 알려져 있다 (Table 1).

한국인에서 제2형 당뇨와 관련된 대사체 마커 발굴을 위해 지역사회 기반 코호트의 유전체 연구에 참여한 동일인을 대상으로 2,240건의 혈청 시료에 대해 Biocrates사 플랫폼을 사용하여 표적화 방법으로 대사체 데이터를 생산하였다. 대사체 분석은 액체 크로마토그래피 질량분석기(LC-MS)와 흐름 주입 분석법 질량분석기 (FIA-MS)를 이용하여 총 186개의 대사체를 μM 범위내에서 정량 하였으며, 이중, 품질관리기준에 적합한 123개의 대사체를 선별하였으며, 미국당뇨병학회의 제2형 당뇨 진단 기준에 따라 구분된 그룹간 (정상군; 924명, 당뇨 위험군; 799명, 당뇨군; 517명)에 유의한 차이를 보이는 대사체를 확인하였다 (Figure 2). 그림 2A는, 나이, 성별, 체질량 지수 및 고밀도 지단백 수치를 공변량으로 사용하여 그룹간 다변수 로지스틱 회귀분석 (모델I, 당뇨 그룹 ~ 대사체+나이, 성별, 체질량 지수, 고밀도 지단백)을 수행 결과 이며, 그림 2B는 모델 I에 추가적으로, 중성지방, 당화혈색소, 공복 혈당 및 공복 인슐린 수치를 공변량으로 사용하여 그룹간 다변수 로지스틱 회귀분석 (모델 II, 당뇨 그룹 ~ 대사체+모델I+중성지방, 당화혈색소, 공복 혈당, 공복 인슐린)을 수행한 결과 이다. 모델에 따라 그룹간에 유의한 증감의 변화를 보이는 대사체를 확인할 수 있으며, 이 중 C16, PC ae C36:0과 Glycine, lysoPC a C18:2가 두 모델의 정상 또는 당뇨위험 군과 제2형 당뇨 군과의 비교에서 공통적으로 변화를 보이는 대사체로, 제2형 당뇨와 관련이 높은 마커로 선별되었다. 이들 대사체 마커는 경구당부하 혈당 수치와의 다변수 선형 회귀분석 (경구당부하 혈당 ~ 대사체 + 모델 I/II)을 통해 방향성과 유의성이 확인 되었으며, 지역사회 코호트와 독립적인 독일의 코라(KORA) 코호트를 이용한 재현성 분석을 통해 C16, Glycine, lysoPC a C18:2이 제2형 당뇨와 유의한 관련성이 있음이 검증 되었다.

제2형 당뇨 대사체 마커와 연관된 유전변이 확인
생명현상의 시작이 되는 유전체를 연구하기 위한 전장유전체연관분석(GWAS)과 생명현상의 최종단계로 나타나는 표현형을 가장 가까이 대변하는 대사체와의 연관 분석은 유전적 요인과 환경적 요인에 영향을 받아 나타나는 질병의 원인과 기작을 규명하는데 중요한 정보를 제공 할 수 있다. 이러한 필요성에 의해 유전체-대사체 연관 분석법(mGWAS, GWAS with metabolomics)이 등장하게 되었다. 2008년 인체 혈액 시료를 이용한 대사체와 유전체간의 연관 분석법은 대사체를 통해 유전변이에 의한 기능 설명 가능성을 처음으로 제시하였고 [3], 이후, 여러 연구를 통해 다양한 질병의 원인이나 표현형의 차이에 대한 유전적 영향력과 기능을 이해하는데 응용되고 있다. 제2형 당뇨와 연관성이 높은 것으로 알려진 TCF7L2 rs7903146 유전변이의 경우 혈액내 sphingophospholipid 와 glycerophospholipid의 비정상적 대사작용 유도를 통해 당뇨 진행과 관련성이 있음이 보고 되었다 [4]. 또한 한국인에서 제2형 당뇨와 비만에 연관성이 높은 것으로 보고된 FTO rs9939609의 유전형에 따라 phosphatidylcholine 대사 경로에 관여하는 대사체들이 확인 되었으며 [5], 이는 대사체-유전체 연관분석이 개개인의 질환 감수성 차이에 따른 당뇨 및 비만 발생을 이해하는데 유용한 정보로 활용 가능하다는 것을 의미한다.
이에, 지역사회 코호트로부터 발굴된 제2형 당뇨 관련 대사체와 통계적 유의성을 보이는 유전변이를 확인하기 위해, 대사체-유전체 연관분석을 수행하였다. 그 결과, 제2형 당뇨 관련 대사체와 유의한 연관성을 보이는 10개의 유전변이가 선별 되었다 (Table 2). 이들 중 C16과 연관성을 보이는 NEGR1, Glycine과 연관성을 보이는 CPS1, KPZL3, HECTD4, OAS1, 그리고 lysoPC a C18:2와 연관성을 보이는 FADS1등은 이미 전장유전체연관분석을 통해 제2형 당뇨, 혈당 수치 및 비만에서 유전적 감수성에 대한 영향력이 보고되었다. 이러한 결과는 대사체를 통해 제2형 당뇨 관련 유전변이의 기능적 역할에 대한 증거 제시뿐만 아니라, 당뇨의 발병 기작을 규명하기 위한 중요한 단서로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.


III. 맺는 말

대사체 연구를 통한 제2형 당뇨에 대한 병인학적 지식의 확장과 새로운 예측 바이오마커의 발굴은 당뇨의 조기 진단과 치료 효율을 높이는데 도움을 줄뿐만 아니라, 유전체와의 연관 분석을 통해 질환 연관 유전변이의 기능에 대한 근거를 제시할 수 있다. 본 글에서 지역사회 코호트 참여자를 대상으로 표적화 대사체 분석 및 유전체와의 연관 분석을 통해, 미토콘드리아 내 지방산 산화 증가, 활성산소 유도로 인한 염증신호 활성, 그리고 인슐린 시그널 저해와 관련되어 인슐린 저항성을 증가시킬 것으로 예상되는 제2형 당뇨 대사체 마커를 발굴 하였으며, 이것들과 연관이 있는 유전변이 확인을 통해 당뇨 관련 유전변이에 대한 기능적 근거를 제시하였다. 추가적인 추적 연구와 분자생물학적 연구를 통해 이들의 직접적인 당뇨와의 인과관계에 대한 검증이 요구되기는 하지만, 이러한 연구는 한국인에서 당뇨를 예방하고 치료하기 위한 의료 기술 개발과 정밀 의료 실현을 위한 유용한 정보와 지식을 제공하는데 활용될 수 있다.


IV. 참고 문헌

1. Amelie B., Philippe F. Rare and common genetic events in type 2 diabetes: What should biologists know?. Cell Metabolism. 2015, 21:357-368.
2. Raamsdonk L., Teusink B., Broadhurst D., et al. A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations. Nature Biotechnology. 2001, 19(1):45-50
3. Gieger C., Geistlinger L., Altmaier E., et al. Genetics meets metabolomics: a genome-wide association study of metabolite profile in human serum. PLos Genetis. 2008, 4(11):e1000282.
4. Then C., Wahl S., Kirchhofer A., et al. Plasma metabolomics reveal alterations of sphingo- and glycerophospholipid levels in non-diabetic carriers of the tranion factor 7-like 2 polymorphism rs7903146. PLoS One. 2013, 8(10):e78430.
5. Kim Y.J., Lee H.S., Kim Y.K., et al. Association of Metabolites with Obesity and Type 2 Diabetes Based on FTO Genotype. PLoS One. 2016, 11(6):e0156612.