Abstract


Isolation and genetic characterization of Orientia tsutsugamushi from patients with scrub typhus in Gyeongsangnam-do, 2015

Shin Min-Kyoung, Lee Woo-Kon
Department of Microbiology, Gyeongsang National University School of Medicine
Lee Kyeoung Min, Hwang Kyu Jam
Pathogen Resource TF, Center for Infectious Diseases, KNIH, KCDC

Tsutsugamushi disease, also known as scrub typhus, which is endemic to an Asia-Pacific region, has increased its incidence and caused annually around 10 thousand patients in Korea in the past several years. In the present study, we isolated 44 Orientia tsutsugamushi, as a causative agent of scrub typhus, from the patients with febrile illness accompanied with or without an eschar in Gyeongsangnam-do, Korea. These isolates were characterized by genetic analysis of the major outer membrane protein, the 56-kDa type-specific antigen (TSA56), which is unique to O. tsutsugamushi. Two types of sequences of tsa56, designated by JJ1 and JJ2, were determined from 37 and 7 isolates of the 44 isolates, respectively. JJ1 and JJ2 showed 74.7-90.8% identity in nucleotide sequence and 66.1-90.5% identity in amino acid sequence with 34 reference strains except for Boryong and Kuroki. JJ1 and JJ2 had 100 and 99.9% nucleotide identity to Boryong strain, and 99.9 and 99.8 % to Kuroki, which has been known to be similar to Boryong, respectively. In addition, they showed 77.9-81.4% nucleotide identity with the cluster of Gilliam-related genotypes, whereas they showed higher nucleotide identity (89.6-90.8%) with the cluster of Karp-related genotypes. To our knowledge, this is the first report to isolate O. tsutsugamushi and characterize their genotype as the Boryong in Jinju and western Gyeongsangnam-do, Korea, even though it has been reported that the Boryong was the predominant genotype in isolates from chiggers, domestic rodents, and patients in the southern part of Korea. Furthermore, our isolates could be useful source to study on the pathophysiology and epidemiology of scrub typhus in Korea.

Keywords: Orientia tsutsugamushi, Scrub typhus, Incidence, Genetic analysis, Genotype



  들어가는 말


쯔쯔가무시증(scrub typhus)은 Orientia tsutsugamushi에 감염된 털진드기(trombiculid mite)의 유충에 물렸을 때 사람에게 전파되어 혈액과 림프액을 통한 전신성 혈관염을 임상 특징으로 하는 급성 발열성 질환이다[1]. 진드기에 물린 자리에 가피(eschar)가 형성되고 발진과 고열이 동반되는 특징적인 병리 소견을 나타내며 두통, 오한, 기침, 구토, 근육통, 복통 및 인후염과 같은 비특이적 임상 징후가 관찰된다. 결막 충혈 및 피부 발진, 그리고 때로는 수막염, 파종성 혈관 내 응고 및 다발성 장기 부전과 같은 심각한 합병증을 동반하기도 한다[2, 3]. 아직까지 예방백신이 없기 때문에 진드기와의 접촉을 회피하는 등의 물리적 제어를 통해 쯔쯔가무시증을 예방하는 것이 가장 좋으며, 감염 초기에는 적절한 항균제 치료로 쉽게 회복될 수 있지만 치료시기를 놓치는 경우 치명적일 수도 있다[4]. O. tsutsugamushi가 지닌 외막 단백질인 56-kDa형 특이 항원(type-specific antigen, TSA)의 다양성에 따라 이 세균을 Gilliam, Karp, Kato, Kawasaki, Kuroki, Shimokoshi, Boryong, Yonchon 등과 같은 다양한 혈청형(serotype)으로 분류 할 수 있다. 절대 세포내 기생체인 이 세균이 숙주세포에 부착하고 침투하는데 필수적인 56-kDa TSA 유전자(tsa56)는 4 개의 변이 도메인(variable domain I～IV)을 가지고 있고 혈청형에 따른 염기서열의 특이성을 나타내기 때문에 각 혈청형 별로 특이한 PCR primer를 이용하면 분자생물학적 혈청형 분석(molecular serotyping)이라고 불리는 유전형 분석(genotyping)이 가능하다[6, 11]. 인체 감염시 O. tsutsugamushi의 병원성은 혈청형(또는 유전형)에 따라 차이를 나타내기 때문에 이 세균 혈청형의 지리적 분포는 지속적인 역학 조사의 대상이다.
쯔쯔가무시증은 동쪽의 일본 북부 및 시베리아 연해주에서 서쪽의 파키스탄과 파미르 고원, 호주 북부를 잇는 아시아 태평양 지역의 쯔쯔가무시 삼각지대에서 발생하는 지역 풍토병이며 혈청형의 분포는 지리적으로 다양하다[3, 7]. Gilliam, Karp, Kato, TA678, TA686, TA716, TA763 및 TH1817은 태국, 말레이시아, 필리핀 및 호주에서 확인된 혈청형이며[6], 일본에서는 Gilliam, Karp, Kato, Kawasaki, Shimokoshi, Irie, Hirano 등의 혈청형이 분리되었다[6]. 호주와 러시아에서는 각각 TA716과 Gilliam이 우세하게 분리되며[8], Karp와 TA716은 타이완에서 가장 우세한 혈청형이다[5, 8]. 한국에서는 Boryong이 남부지방에서 가장 흔하게 분리되는 혈청형이며, 북부와 중부지방에서는 Karp와 Gilliam 혈청형이 동정되고 있다[6]. Chang et al.[9]과 Ree et al.[6]은 각각 1990년과 2001년에 연구 보고를 통해 경상남도 지역의 감염 환자, 털진드기 및 야생 들쥐에서 분리·동정된 O. tsutsugamushi의 혈청형이 Boryong이라는 사실을 각각 혈청학적 및 분자생물학적 방법으로 확인한 바 있다. Boryong과 Kuroki를 비교했을 때 56-kDa TSA 변이 도메인의 뉴클레오타이드와 아미노산 서열이 99.9%의 상동성을 나타내지만 Kuroki와는 생쥐에 대한 병원성 및 Karp 특이성 단일클론 항체인 KP10에 대한 반응성에서 다른 특징을 보였다(2). 이 연구에서는 진주를 비롯한 경남 서부지역에서 최근에 발생한 쯔쯔가무시증 환자로부터 O. tsutsugamushi를 분리하였고 이들의 tsa56 염기서열을 분석하여 이 지역 분리주의 특성을 규명하고자 하였다.



  몸 말


연구재료 및 방법


1) 쯔쯔가무시증 환자로부터 O. tsutsugamushi의 분리 및 동정
2015년 10월부터 12월까지 경상남도 진주시 소재 경상대학교병원에 내원한 발열 환자 중 가피가 확인된 환자로부터 O. tsutsugamushi균 분리를 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액은 3,000 rpm에서 10 분간 원심분리 한 후 buffy coat를 포함한 원침세포를 8주령 C3H 마우스에 복강 내로 접종하였다. 접종 후 2～3주 동안 관찰하면서 활력징후가 저하되는 마우스를 희생시키고 무균적으로 분리한 비장세포를 단층배양한 L-929 마우스 섬유아세포주(mouse fibroblast)에 접종하였다. 감염된 세포는 세포병변효과(cytopathic effect)가 나타날 때까지 35℃, 5% CO2 조건 하에서 주 2회 배지를 교체하며 유지하였다. 세포내 O. tsutsugamushi의 감염 유무는 간접면역형광염색(indirect immunofluorescent antibody assay)을 통해 확인하였다[9, 10]. 진단용 항체는 역가가 1:128 이상인 쯔쯔가무시증 병력을 가진 환자 10명의 혼합 혈청을 사용하였다. 간접면역형광염색으로 O. tsutsugamushi 감염이 확인된 세포는 즉시 부유액을 만들어 –80℃에 냉동 보관하였고 일부는 tsa56 유전자에 대한 PCR 증폭과 염기서열 분석을 위해 DNA 추출을 실시하였다[6, 11]. O. tsutsugamushi로 동정된 균주는 국가병원체자원은행(NCCP, Cheongju, Korea)에 기탁되었다.

2) tsa56 유전자의 PCR 증폭 및 염기서열 분석
O. tsutsugamushi 감염이 확인된 L-929 세포로부터 DNeasy tissue kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 56-kDa TSA 유전자(tsa56)의 증폭 반응은 Furuya et al.[11]의 방법에 따라 수행하였으며 여기에 사용된 primer set는 p34 (forward primer, 5'-TCAAGCTTATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’) 및 p55 (reverse primer, 5'-AGGGATCCCTGCTGCTGTGCTTGCTGCG-3’)이다[11]. PCR 증폭조건은 다음과 같다. 94℃에서 7분간 초기 변성 후 94℃ 1분, 57℃ 1분 및 72℃ 1분의 사이클을 35회 반복한 다음 72℃에서 10분간 최종 증폭반응을 유도하였다. GeneAll PCR SV (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 PCR 산물을 정제하였고 automatic dye terminator DNA sequencing (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 기기를 사용하여 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다.

3) 계통 분석(Phylogenetic analysis)
DNA 염기서열 자료는 MegAlign 5.0 DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, USA)를 사용하여 BLASTN 데이터베이스(National Center for Biotechnology Information) 내의 tsa56 참조서열과의 쌍대비교(pair-wise comparison) 분석을 통해 상동성(nucleotide identity)을 산출하였다. 계통 분석은 MEGA software (version 6.0, Arizona State University, Tempe, USA)를 이용한 Neighbor-joining과 boostrap analysis (500 repeats) 방법으로 수행하였다.

연구결과 및 고찰

최근 3년간(2013～2015) 경상대학교병원에서 치료를 받은 쯔쯔가무시증 환자는 Figure 1에 나타난 바와 같다. 2013년에 78명이었던 환자수는 2014년에 50명으로 감소하였다가 2015년에 다시 94명으로 증가하였는데 이는 질병관리본부의 법정감염병 전수감시 환자발생 신고 현황의 변화 추이와 유사한 패턴을 보였다. 월별 환자 현황은 9월부터 환자가 내원하기 시작하여 10월에서 12월 사이에 대부분의 환자가 집중되는 양상을 보였으며 11월에 가장 환자수가 많았다.
2015년 경상대학교병원에 내원한 급성 열성 질환 환자 중 쯔쯔가무시증으로 확진되었거나 추정 진단된 환자는 94명이었다. 이들 환자 중 혈액 채취가 가능하였던 57명 환자 검체를 C3H 마우스에 접종하였고 다시 마우스 비장세포를 접종한 L-929 세포 배양에서 총 44 검체가 세포병변효과를 나타냈다. 이들 각각의 배양 용기로부터 일부 세포를 회수한 후 절반은 분자생물학적 동정을 위한 유전체 DNA 분리에 사용하였고 나머지 세포는 슬라이드글라스에 고정한 다음 1:500으로 희석한 쯔쯔가무시증 양성 환자의 혼합 혈청(서울의대 미생물학교실 제공)을 이용하여 간접면역형광염색을 실시하였다. 형광현미경 검경을 통해 44개 검체 모두로부터 배양세포 내에서 증식된 균체 입자가 확인되어 O. tsutsugamushi로 동정하였으며 이들 세포를 모두 회수하여 액체질소에 냉동 보관하였다. 한편 분자생물학적 동정을 위해 O. tsutsugamushi의 종 특이적 표지자(species-specific marker) 유전자인 tsa56을 대상으로 PCR을 시행한 결과 모든 검체에서 1,028bp 길이로 예측되는 DNA 증폭 산물이 관찰되어 이들이 O. tsutsugamushi 분리균주라는 사실을 재확인할 수 있었다(Figure 2). 이들 총 44명 쯔쯔가무시증 양성 환자의 남녀 구성비는 남성이 18명, 여성이 26명으로 남성보다 여성의 수가 더 많았다. 환자의 연령 분포는 10대에서 80대까지 거의 모든 연령대를 포함하고 있었으며 각 연령대별 환자 수는 각각 10대 1명, 30대 1명, 40대 1명, 50대 10명, 60대 6명, 70대 20명 및 80대 5명으로 대부분의 환자가 고령층에 속해 있었으며 70대 환자가 가장 많았다.
본 연구에서 분리한 44개 균주의 유전적 특성을 파악하기 위해 tsa56 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과 JJ1형과 JJ2형의 두 가지로 구분할 수 있었다. JJ1과 JJ2 간의 아미노산 서열은 동일하였고 염기서열은 99.9%의 상동성을 보였다. JJ1과 JJ2에 해당하는 균주 수는 각각 37개 및 7개 균주였다. 이 두 가지 형의 염기서열을 이용하여 36종 참조균주의 tsa56 염기서열 및 아미노산 서열과의 상동성 분석 및 계통 발생 분석을 시행하였다. JJ1과 JJ2는 Boryong과 Kuroki를 제외한 34개 염기서열과 74.7～90.8%의 뉴클레오티드 상동성 및 66.1～90.5%의 아미노산 상동성을 보였다. JJ1과 JJ2는 각각 Boryong 균주와 100%와 99.9%의 뉴클레오티드 상동성을 보였고, Boryong과 유사하다고 알려진 Kuroki와는 각각 99.9%와 99.8%의 상동성을 나타냄으로써 JJ1과 JJ2는 모두 Boryong 및 Kuroki와 동일한 유전형 집단(cluster)에 속해 있었다(Table 1, Figure 3). 또한 FPW2016, Gilliam, Ikeda, Kawasaki, TW461, UT125, UT144, UT196 및 Yonchon으로 구성된 Gilliam 관련 유전형 집단과 77.9～81.4%의 뉴클레오티드 상동성을 보인 반면, Hirahata, Je-Cheon, Karp, LA-1, TW45R, UT176, UT177, Yeojoo 등으로 구성된 Karp 관련 유전형 집단과 더 높은 뉴클레오티드 상동성(89.6～90.8%)을 보였다(Table 1, Figure 3).
과거 국내에서 Chong et al.[12]은 중부 경남지방인 진해 지역에서 쯔쯔가무시증 환자로부터 O. tsutsugamushi 11개 균주를 분리하여 Gilliam, Karp 및 Kato 균주에 특이한 단일클론 항체를 사용한 간접면역과산화효소염색법(indirect immunoperoxidase test)으로 혈청형 동정을 시행하여 10개 균주가 Karp 혈청형으로 확인되었다고 보고한 바 있다. 비록 1989년에 이들이 Karp로 동정되었지만 1990년에 충남과 전북, 경남지역 분리균주가 국내 고유의 새로운 혈청형인 Boryong으로 확인되었고[9] 이후 경남지역의 털진드기와 야생 들쥐에서 분리된 대부분의 O. tsutsugamushi가 분자생물학적 동정을 통해 Boryong으로 확인되었기 때문에[6] 앞서 Karp로 동정되었던 분리균주들은 실제로는 Boryong형 균주일 가능성이 높다. 본 연구에서 분리된 균주들의 유형(JJ1과 JJ2)을 3가지 original prototypes(Gilliam, Karp 및 Kato)과 비교했을 때 Karp(84.6 %)와 아미노산 상동성이 가장 높았다는 사실(Table 1 및 Figure 3)을 감안하면 진해 지역 분리주들이 왜 이전 보고서에서 혈청학적으로 Karp로 동정되었는지에 대한 설명이 가능하다. Boryong이 한국 남부지방에서 유행하는 쯔쯔가무시증의 주된 원인 혈청형 또는 유전형이라는 사실이 이미 알려져 있지만 현재까지 진주를 비롯한 서부 경남지역에서 분리된 균주에 대한 형별 조사는 시행된 바가 없다. 본 연구에서는 서부 경남지역의 쯔쯔가무시증 환자로부터 원인균을 처음 분리하였고 이들의 유전적 특성을 조사하여 이 지역에 분포하는 O. tsutsugamushi 역시 Boryong 유전형이라는 사실을 확인하였다. 본 연구를 통해 분리된 균주는 한국에서의 O. tsutsugamushi 감염에 대한 미생물 및 역학 연구에 유용한 연구 소재가 될 수 있을 것으로 사료된다.



  맺는 말


Orientia tsutsugamushi는 아시아-태평양 지역에 유행하는 감염성 질환으로, 국내에서는 매년 만 명 내외의 환자가 발생하고 있다. 본 연구에서는 경상남도 지역의 급성 열성질환 환자로부터 44주의 O. tsutsugamushi를 분리하였다. 이들 분리주를 대상으로 O. tsutsugamushi 균종 특이 외막 단백질 항원 유전자인 tsa56에 대한 유전적 분석을 실시하였다. 본 연구에서 JJ1 및 JJ2로 명명된 두 가지 유전형으로 분석되었으며, 총 44개 균주 중 각각 37주 및 7주가 이에 속하였다. JJ1과 JJ2는 모두 Boryong과 Kuroki에 대하여 99.8%～100%의 높은 염기서열 상동성을 보였고 아미노산 서열의 비교에서는 모두 100% 일치하는 것으로 확인되었다. Boryong과 Kuroki를 제외한 나머지 34개의 참고균주들과의 염기서열 비교에서 JJ1과 JJ2는 74.7～90.8%로 비교적 낮은 상동성을 나타내었고, 아미노산 서열 비교에서도 66.1~90.5%로써 역시 낮은 상동성을 보였다. 계통발생분석에서 JJ1과 JJ2는 Gilliam 관련 유전형 집단(Gilliam group)과 77.9～81.4%의 유전적 상동성을 나타낸 반면, Karp 관련 유전형 집단(Karp group)과는 89.6～90.8%의 더 높은 유전적 상동성을 나타내어 이 연구에서 분리된 균주들이 계통발생적으로 Karp와 더 가깝다는 사실을 확인할 수 있었다. 국내 일부 남부지역의 진드기와 야생 설치류 및 환자로부터의 분리 균주를 조사하여 Boryong이 남부지방의 대표적 유행주라고 보고된 바 있으나 본 연구에서는 진주를 포함한 경남 서부지역에서 처음 환자로부터 O. tsutsugamushi를 처음 분리하였고 이들의 유전형을 분석하여 경남 서부지역 유행주 또한 Boryong이라는 사실을 확인하였다. 이 분리 균주들은 국내 쯔쯔가무시증의 병태생리학 및 역학 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

이 글은 질병관리본부 학술연구개발용역과제인 “병원체 수집 보존은행”의 수행 결과로 출판된 <J Bacteriol Virology. 2016;46(4):275-82> 내용을 포함하여 작성한 글입니다.



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