Abstract

Poly-γ-d-glutamic acid capsule of Bacillus licheniformis, a surrogate of Bacillus anthracis capsule induces interferon-gamma production in natural killer cells through interaction with macrophages

Jeon Jun Ho, Lee Hae-Ri, Rhie Gi-eun
Division of High-risk Pathogens, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC

The poly-γ-d-glutamic acid (PGA) capsule, a major virulence factor of Bacillus anthracis, provides protection to the bacterium from phagocytosis, thereby facilitating unimpeded bacterial growth in the host. We investigated the crosstalk between murine natural killer (NK) cells and macrophages stimulated with the PGA capsule of Bacillus licheniformis, a surrogate of B. anthracis capsule. PGA induced interferon-gamma (IFN-γ) production from NK cells cultured with macrophages. This effect was dependent on macrophage-derived interleukin (IL)-12 and cell-cell contact between NK cells and macrophages through NK cell receptor NKG2D and its ligand RAE-1. Thus, PGA may enhance NK cell activation by inducing IL-12 production in macrophages and facilitating a contact-dependent crosstalk with macrophages.

Keywords: NK cell activation, Poly-γ-d-glutamic acid, Interferon-gamma, Bacillus anthracis, Bacillus licheniformis



들어가는 말


탄저균(Bacillus anthracis)은 아포를 형성하는 그람양성균으로 미국 질병관리본부(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에서 생물무기화 가능성에 따라 지정한 위험단계 중 최상위인 Tier1 select agent에 속하는 고위험 병원체이다[1, 2]. 탄저균은 부종독소(edema toxin)와 치사독소(lethal toxin)와 같은 외독소를 분비하며 이들은 탄저균의 숙주 감염 시 각각 부종과 세포 사멸을 유도하는 주요 병독력인자로 알려져 있다[3]. 또한 탄저균의 외막을 구성하는 poly-γ-d-glutamic acid (PGA) 캡슐은 숙주 면역세포의 포식작용을 억제하여 탄저균을 보호하는 역할을 한다[4].
자연살해세포(natural killer cells)는 병원성 미생물 감염 시 최전방에서 방어를 수행하며 세포독성 및 사이토카인 분비를 통하여 미생물의 침입 및 확산을 억제하는 주요 면역세포 중 하나이다. 미생물 감염 시 자연살해세포의 활성화를 위해서는 단핵구(monocytes), 대식세포(macrophages) 또는 수지상세포(dendritic cells)와 같은 다른 면역세포와의 상호작용이 필요하다. 이러한 상호작용에는 다른 면역세포와의 직접적인 접촉 또는 인터루킨(IL)-12, IL-18과 같은 사이토카인을 통한 간접적인 자극이 포함될 수 있다[6].
자연살해세포로부터 분비되는 인터페론(interferon, IFN)은 미생물 감염 시 숙주의 방어기전에 중요한 역할을 수행한다[7]. 예를 들면 Mycobacterium tuberculosis와 Francisella tularensis와 같은 세포내 침입 미생물 감염 시 Type I 인터페론(IFN-α, IFN-β)과 Type II 인터페론(IFN-γ)이 숙주 방어면역반응에 중요한 역할을 함이 알려져 왔다[8, 9]. 탄저균 포자는 자연살해세포에서 IFN-γ의 생산을 유도하는 것으로 알려졌으며, 흡입탄저 모델 및 탄저균 세포 감염실험에서 IFN-γ를 처리한 마우스와 대식세포의 생존율을 증가 시킬 수 있음이 알려져 왔다. 또한 자연살해세포에서 분비된 IFN-γ는 탄저균 감염 시 숙주의 방어기전에 중요한 역할을 함이 보고되었다[10-12]. 하지만 탄저균의 PGA 캡슐이 자연살해세포를 활성화시켜 탄저균에 대한 숙주의 방어면역반응을 유도하는 지에 대해서는 아직까지 알려져 있지 않다.
이 글에서는 PGA 캡슐에 의한 자연살해세포의 활성화와 이에 대한 기전에 대하여 기술하고자 한다.


몸 말

PGA 캡슐이 마우스의 비장세포(splenocyte)에서 IFN-γ의 분비를 유도하는지를 알아보기 위하여 100 ㎍/㎖의 PGA를 비장세포에 48시간 동안 처리한 후 배양액에 존재하는 IFN-γ의 양을 면역효소분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)을 이용하여 확인하였다. Figure 1A에서 보는 바와 같이 PGA가 처리된 비장세포에서 IFN-γ 단백질이 발현되었다. 자연살해세포는 IFN-γ를 생산하는 주요 세포로 알려져 있으므로 자연살해세포를 제거한 비장세포에 PGA를 처리하여 IFN-γ의 생산이 유도되는지 조사하였다. Figure 1A에서와 같이 PGA에 의한 IFN-γ 생산은 자연살해세포를 제거한 비장세포에서 현저히 감소하였다(P = 0.009).
자연살해세포와 대식세포의 상호작용이 미생물 감염에 의한 IFN-γ 생산에 중요한 역할을 함이 알려져 있으므로 골수유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophages, BMDMs), 자연살해세포 단독 또는 골수유래 대식세포와 자연살해세포를 혼합하여 배양 시 PGA가 IFN-γ의 생산을 유도할 수 있는 지 조사하였다. Figure 1A에서 보는바와 같이 PGA는 자연살해세포에서 IFN-γ의 생산을 유도하였으며 골수유래 대식세포에서는 유도하지 못하였다. 또한 자연살해세포와 골수유래 대식세포를 동시 배양한 세포에 PGA를 처리할 경우 자연살해세포 단독에 비하여 PGA에 의한 IFN-γ 생산이 통계적으로 유의하게 증가되었다(P < 0.05). PGA로 자극한 비장세포에서 분비되는 IFN-γ의 주된 생산자가 자연살해세포임을 추가로 확인하기 위하여 자연살해세포 특이 형광항체 및 공초점현미경(confocal microscope)을 이용하여 조사하였다. Figure 1B에서 보는 바와 같이 PGA는 자연살해세포 특이 마커인 NK1.1 표면항원을 보유하고 있는 세포에서만 IFN-γ의 생산을 유도함을 확인할 수 있었다. 따라서 비장세포 중에서 자연살해세포가 PGA 자극 시 IFN-γ를 생산하는 주된 세포임을 확인할 수 있었다.
자연살해세포가 IFN-γ를 분비하기 위해서는 다른 사이토카인의 자극 또는 수용체를 통하여 이웃 세포와의 직접적인 접촉이 필요하며, 특히 탄저균 감염 시 자연살해세포에 의한 IFN-γ 분비에 대식세포가 생산하는 IL-12가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 PGA가 비장세포와 골수유래 대식세포를 자극하여 IL-12의 분비를 유도하는지 조사하였다. 그 결과, Figure 2A에서 보는바와 같이 PGA는 통계적으로 유의하게 비장세포와 골수유래 대식세포에서 IL-12의 분비를 유도하였다(P < 0.05). PGA 자극에 의하여 자연살해세포에서 유도되는 IFN-γ 생산에 대식세포가 분비하는 IL-12의 역할을 알아보기 위하여 자연살해세포와 대식세포를 동시 배양한 세포(Figure 2B)와 비장세포(Figure 2C)에 각각 대조군 항체와 IL-12 중화항체를 1시간 전 처리 한 후 PGA를 24시간 또는 48시간 동안 처리하였다. 그 결과 자연살해세포와 대식세포를 동시 배양한 세포 그리고 비장세포 모두에서 대조군 항체를 처리한 그룹에 비해 IL-12 중화항체를 처리한 그룹에서 PGA에 의한 IFN-γ 분비가 통계적으로 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(P < 0.05). 이러한 결과들을 종합해 볼 때 PGA 자극에 의해 대식세포에서 생산되는 IL-12가 자연살해세포의 IFN-γ 분비에 중요함을 확인할 수 있었다.
다음으로 PGA에 의한 IFN-γ 생산에 자연살해세포와 대식세포사이의 세포간 접촉의 필요성을 자연살해세포와 대식세포 간의 직접적인 접촉을 막을 수 있는 transwell을 사용하여 조사하였다. Figure 3A에서 보는 바와 같이 PGA를 처리한 골수유래 대식세포의 배양액은 transwell을 이용하여 대식세포와 자연살해세포 간 접촉을 막았을 경우에 IFN-γ의 분비를 거의 유도하지 못하였다. 따라서 세포간 접촉이 IFN-γ의 분비에 중요함을 확인할 수 있었다. 자연살해세포 활성화 유도 수용체인 NKG2D가 자연살해세포의 IFN-γ 분비에 중요함이 알려져 있으므로 자연살해세포와 PGA로 자극한 대식세포 간 상호작용에 의한 IFN-γ 분비에 NKG2D 수용체가 관여하는 지를 조사하였다. NKG2D 수용체에 대한 중화항체를 처리할 경우 PGA에 의한 IFN-γ 분비가 약 55%(P=0.01) 감소하였으며, 또한 NKG2D 수용체의 리간드(ligand)들 중 하나인 RAE-1에 대한 중화항체를 처리한 경우에도 PGA에 의한 IFN-γ 분비가 약 57%(P = 0.01) 감소하였다(Figure 3B). 이러한 결과들을 종합해볼 때 PGA에 의한 자연살해세포의 활성화와 IFN-γ 분비에 NKG2D와 RAE-1 결합을 통한 대식세포와의 세포간 접촉이 중요함을 확인할 수 있었다.


맺는 말


이 연구에서는 PGA에 의해 활성화된 대식세포와 자연살해세포 간의 상호작용을 통한 자연살해세포의 활성화 기전에 대하여 조사하였다. 그 결과 활성화된 대식세포에서 분비되는 IL-12와 NKG2D-RAE-1 결합을 통한 대식세포와 자연살해세포 간 상호작용이 PGA에 의한 IFN-γ 분비에 필요함을 확인할 수 있었다. 그러나 보다 더 자세한 기전을 밝히기 위하여 IL-18, IL-15 그리고 type I IFNs와 같은 soluble factor 뿐만 아니라 NKp30, NKp46과 같은 자연살해세포 활성화 수용체가 자연살해세포에서의 IFN-γ 분비에 관여하는지에 대한 추가 연구가 필요하다.
이 연구결과는 탄저균 캡슐에 의한 탄저병 기전을 이해하고, 백신과 치료제 개발을 위한 주요 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

이 연구단신은 Journal of Microbiology and Biotechnology 2017;27(5):1032-7에 게재된 논문의 재편집을 통해 작성되었습니다.


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