병원감염 열대열 말라리아 환자의 유전자형 분석에 의한 역학적 원인 규명

Epidemiologic investigation through genetic analysis of Nosocomial Falciparum malaria infection

 질병관리본부 면역병리센터 말라리아·기생충팀
전염병대응센터 역학조사팀

Ⅰ. 들어가는 말
    말라리아는 Plasmodium 속 원충이 적혈구와 간 세포내 기생함으로써 발병되는 급성 열성 감염증이며, 원충이 인체의 적혈구 내에 기생하면서 적혈구가 파괴되어 주기적인 열발작, 빈혈, 비종대 등의 전형적인 증상을 나타내는 특징을 보인다. 최근 원숭이
말라리아가 인수공통 말라리아로 확인된 보고도 있지만, 인체에서 발병하는 말라리아는 주로 열대열, 삼일열, 사일열, 난형열 말라리아의 4종으로 알려져 있다. 우리나라에서는 말라리아를 제3군 법정전염병으로 관리하고 있으며, 현재까지 ‘삼일열말라리아’만 발병되고 있다. 우리나라의 말라리아는 약 4종의 얼룩날개모기류가 매개한다고 보고되고 있으며[1,2,3], 주로 휴전선 인근 지역에서 발생하고 있다. 
  이 글에서는 우리나라에서 발병하지 않았던 열대열 말라리아로 인해 사망한 사례에 대한 역학조사 및 유전자형 분석에 의한 원인 규명에 대해 기술하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말
 1. 사례 조사
  2007년 1월 24일 말라리아 위험지역과 무관한 경남 양산시에 거주하는 L씨가 열대열말라리아로   사망했다는 보고가
질병관리본부 전염병웹보고 시스템에 접수되었다. 이 환자는  1970-71년 사이 베트남 참전 외에는 해외 여행력이 없는 자로서 폐결핵으로 P 지역의 종합병원에 입원해 있던 중 사망하였으며, 사망원인 중 하나로 국내에서 발병하지 않는 열대열말라리아가 진단되었다. 질병관리본부 혈액안전감시팀에서는 이 환자의 최근 3년간 수혈 경력을 조사하고 말라리아기생충팀에서 공혈자의 혈액 3건에   대한 말라리아 추적검사를 하였으나 수혈과는 무관함이 밝혀졌다.
  계절적 특성상 1월은 모기가 동면 중인 점, 열대열 말라리아를 매개하는 모기가 국내에 존재하지 않는 점으로 볼 때 모기 매개에 의한 국내 감염 가능성은 희박하였다. 또한 L씨의 집은 공항으로부터 멀리 떨어진 곳에 위치해 있으며 질병매개곤충팀에서 매년 수행하고 있는 공항, 항만의 검역지역 모기 채집 조사에서 특이한 종의 모기가 발견된 적은 없었으므로
공항 관련 말라리아(airport malaria)일 가능성도 배제되었다.
  P시 역학조사반은 L씨가 동 병원 응급실에서 약 9시간 동안 열대열 말라리아로 치료받다가 사망한 외국인 환자 G씨와 동시 응급실에서 치료 중이었던 사실을 확인하였다. 외국인 G씨는 그리스인으로 입국 3개월 전까지 콩고, 나이지리아 등에 체류하였으며 2006년 12월 24일 국내로 입국하였다. 그 후 25일부터 발열, 근육통 등으로 병원에서 입원 치료을 받았으나 증상이 악화되었으며, 12월 30일 동 병원  응급실에서 치료 중 당일 사망하였고 혈액도말검사 결과 열대열 말라리아로 진단되었다.
  중앙역학조사반은 L씨의 증상발현시기, 수혈감염 또는 매개모기에 의한 말라리아 감염 가능성 배제 등을 고려하였을 때 응급실에서 의료진 또는 의료기구에 의하여 열대열 말라리아에 감염되었을 가능성을 제시하였다.

2. 분석 재료 및 방법
  G씨의 혈액은 조사당시 모두 폐기된 후였기 때문에 유일하게 남은 시료는 혈액도말표본이었으며,   이 2매의 도말 표본을 분쇄하여 혈액을 수집한 후 DNA를 추출하였다. L씨는 EDTA 처리된 전혈 200㎕로부터 DNA 추출키트를 이용하여 DNA를 추출하였다.
추출된 DNA로부터 열대열 말라리아 Merozoite Surface Protein-1(MSP-1) 유전자 중 가장 변이가 다양하다고 보고되어 있는 Block 2 부위와 Block 17 부위를 PCR에 의해 증폭하였다[4]. 두 시료에 대한 PCR은 각각 별도의 장소에서 수행되었으며 PCR
교차오염에 대한 증거 확보를 위하여 미얀마 유래 열대열 말라리아 환자의 시료를 양성 대조군으로 함께 증폭하였다. 이 증폭산물들에 대해 직접 서열을 확인하기도하고 클로닝도 수행하여 염기서열을  분석하였다. 또한 G씨가 최근 3개월간 나이지리아, 콩고
등에 체류하였으므로 아프리카 기원 열대열  말라리아 여부를 조사하기 위하여 MSP-1 전체 유전자를 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.
  병원 내 감염에 대한 자료 확보를 위하여 당시 P 병원 응급실에서 근무했던 36명의 의료진과 입원 환자 34명의 시료에 대하여
18s rRNA 유전자에 의한 말라리아 검출 PCR 및 IFAT법에 의한 항체   검사를 수행하였다.

3. 분석 결과
 1) PCR 증폭  
  두 환자의 시료로부터 390bp의 MSP-1 유전자 Block 2 부위 및 390bp의 Block 17 부위가 PCR에 의해 증폭되었다. 이들 산물은 K2 형에 특이적인 K2F, C3R 프라이머에 의하여 증폭되었으며 양성   대조군으로써 함께 증폭한 미얀마 열대열 말라리아 환자
시료의 PCR 산물은 M형인 264bp 산물이    증폭되어 PCR 교차오염은 없었음을 확인하였다. Block 17에 대한 PCR 증폭에서도
두 환자로부터 같은 산물이 증폭되었다(Figure 1). 병원 의료진 및 입원환자에 대한 PCR 및 IFAT 결과는 모두 음성이었다.

 2) 두 환자의 MSP-1 유전자 Block 2 의 염기서열 분석
  모든 PCR 산물은 direct sequence를 수행하였으며 PCR error를 확인하기 위하여 클로닝 후의 염기서열 분석도 병행하였다.
염기서열은 Clustral X 기법에 의하여 분석되었다. Block 2 부위의 염기서열 분석 결과, 두 환자의 염기서열이 완벽하게 일치하였
으며 Ferreira 등[5]에 의해서 보고된 K1형의 변이 분석에서도 동일한 수 및 양상의 반복 서열(3111131111111121)이 관찰되었다. Figure 2에서 보여지는 바와 같이 탄자니아의 열대열 말라리아 환자의 Block 2 서열과는 K2형의 반복 양상이 유사하였으며  미얀마 환자의 것과는 전혀 대조적인 결과가 관찰되었다. 또한 Block 17 부위의 염기서열 분석에서도 동일한 SNP가 관찰되었다.

 
3) MSP-1 유전자 전체 서열 분석을 통한 아프리카 유래 확인 
  아프리카 유래의 열대열 말라리아아임을 확인하기 위하여 5,067bp의 전체 유전자 서열을 block 별로 아프리카 유래의 열대열
말라리아 환자의 결과[6]와 비교 분석한 결과, Table 1과 같이 아프리카 유래의 열대열 말라리아에서 주로 관찰되어지는 염기
서열을 포함하고 있었으며 변이 양상도 아프리카형 열대열 말라리아와 매우 유사함이 확인되었다.

Ⅲ. 맺음말

  경남 양산시 거주 L씨와 외국인 G씨의 혈액에 대한 유전자 비교 분석 및 전체 유전자 확보에 의한 말라리아 발생지의 근원지 규명 조사를 통하여 L씨는 같은 병원 응급실에서 진료 중이던 열대열 말라리아 환자 G씨로부터 말라리아에 감염된 사실을 확인하였다. 이 조사에서 외국인 G씨의 시료는 단 2매의  혈액도말 표본뿐이었으나 질병관리본부 말라리아기생충팀에서는 그 도말 표본으로부터 극히 적은 양의 시료에서 유전자 증폭을 할 수 있었다. Jane 등[8]이 같은 방법으로 말라리아 병원 감염에 대한 유전자 비교 분석을 보고한 예가 있으나 도말 표본에서의 DNA 추출은 상당히 어려운 기술임에는 틀림없다. 또한 본 조사에서 사용된 MSP-1 유전자는 변이가 가장 다양한 부분이기 때문에 두 환자처럼 반복 서열이 완벽하게 일치하기는 쉽지않아 두 환자가 같은 원충을 가지고 있었다는 사실이 명백하며, 전체 유전자 서열 분석을 통하여 아프리카지역에서 기원된 유전자임을 확인함으로써 병원 내 감염에 대한 근거를  뒷받침 할 수 있었다.
  그러나 질병관리본부 중앙역학조사반에서 병원 의무기록 검토 및 의료진 면담 등을 실시하였음에도 어떤 경로를 통하여 G씨로부터 L씨에게 병원 내에서 말라리아가 전파되었는지는 확인할 수 없었다.   다만 외국인 G씨에게 심폐소생술을 실시하였기 때문에 다수의 의료진이 G씨와 직접 접촉 했을 것으로 추정되며 치료 처치 시에 말라리아 감염 예방 조치를 실시하지 않았던 점만이 확인되었을 뿐이다.
  이러한 말라리아의 병원 감염 사례로 외국에서는 수혈, 주사바늘에 의한 손상(needle stick injury),   생리식염수 공동 주사, 장기 이식, 혈당측정기의 공동 사용, Heparin lock(혈액응고를 방지하기 위해  정맥 내 삽입하는 장치)을 통한 감염 등이 보고되고 있다[9,10]. 특히 혈당측정기의 공동 사용이나   간호사의 손에 있던 작은 상처와 같이 매우 적은 양의 혈액에 의해서도 말라리아가 전파될 수 있기   때문에 병원감염을 예방하기 위한 각별한 주의가 필요하다. 질병관리본부는 이 사례의 결과를 반영하여 의료 환경안전관리 대책 중의 하나로 응급실 감염관리지침 개발을 추진하고 있다.

Ⅳ. 참고문헌
 1. Shin EH, Lee WJ, Lee HI, Lee DK, Klein TA. Seasonal population density and daily survival of anopheline mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a
     malaria endemic area, Republic of Korea J Vector Ecol. 2005; 30: 33-40.
2. Lee WJ, Klein TA, Kim HC, Choi YM, Yoon SH, Chang KS, Chong ST, Lee IY, Jones JW, Jacobs JS, Sattabongkot J, Park JS. Anopheles kleini,
    Anopheles pullus, and Anopheles sinensis: Potential Vectors of Plasmodium vivax in the Republic of Korea
3. Shin EH, Kim TS, Lee HW, Lee JS, Lee WJ. Vector competence of Anopheles lesteri Baisas and Hu (Diptera: Culicidae) to Plasmodium vivax in
    Korea. Korean J Parasitol. 2002;40:41-4.
4. Kaneko O, Kimura M, Kawamoto F, Ferreira MU, Tanabe K. Plasmodium falciparum: allelic variation in the merozoite surface protein 1gene in
    wild isolates from southern Vietnam. Exp Parasitol.1997; 86:45-57.
5. Ferreira MU, Ribeiro WL, Tonon AP, Kawamoto F, Stephen MR. Sequence diversity and evolution of the malaria vaccine candidate merozoite
    surface protein-1 (MSP-1) of Plasmodium falciparum. Gene. 2003;304:65-75
6. Tanabe K, Sakihama N, Walliker D, Babiker H, Abdel-Muhsin AA, Bakote’e B, Ohmae H, Arisue N, Horii T, Rooth I, Farnert A, Bjorkman A,
    Ranford-Cartwright L. Allelic dimorphism-associated restriction of recombination in Plasmodium falciparum msp1. Gene. 2007; 397:153-160.
7. Conway DJ, Cavanagh DR, Tanabe K, Roper C, Mikes ZS, Sakihama N, Bojang KA, Oduola AMJ, Kremsner PG, Arnot DE, Greenwood BM,
   McBride JS. A principal target of human immunity to malaria identified by molecular population genetic and immunological analyses. Nat Med.
   2000; 6: 689-692.
8. Jain SK, Persaud D, Perl TM, Pass MA, Murphy KM, Pisciotta JM, Scholl PF, Jain SK, Persaud D, Perl TM, Pass MA, Murphy KM, Pisciotta JM,
    Scholl PF. Nosocomial malaria and saline flush. Emerg. Infect. Dis. 2005;11:1097-1099
9. Alweis RL, DiRosario K, Conidi G, Kain KC, Olans R, Tully JL. Serial Nosocomial Transmission of Plasmodium falciparum malaria from patient to
    nurse to patient. Infect Control Hops Epidemiol;25:55-59
10. Bulrahi HA, Bohlega EA, Fontaine RE, al-Seghayer SM, al-Ruwais AA.  Plasmodium falciparum malaria transmitted in hospital through heparin
     lock. Lancet 1997; 349:23-25.