2007-2008절기 국내 인플루엔자 항바이러스제 내성 분석

Surveillance for antiviral drugs of influenza viruses isolated in Korea during 2007-2008 season

질병관리본부 감염병센터 인플루엔자바이러스팀     

Ⅰ. 들어가는 말
  인플루엔자는 짧은 잠복기와 높은 전염력으로 인해 폭발적인 전파를 가져오며, 표면 항원인 hemagglutinin과 neuraminidase (이하 NA)의 변화에 따른 항원 변이를 통해 매년 새로운 유행이 발생되고 있다. 특히, 인플루엔자는 노약자 또는 만성 질환을 앓고 있는 고위험군 환자에서는 폐렴 등의 합병증으로 인한 입원 또는 사망을 일으킬 수 있는 위험한 질환이다.
  인플루엔자를 예방하는 가장 효과적인 방법은 매년 인플루엔자 백신을 접종하는 것이다. 인플루엔자 백신은 1940년대 후반부터 사용되기 시작한 불활화(inactivated) 백신이 전 세계적으로 가장 널리 이용되고 있다. 현재는 2003년 미국에서 개발된 한냉적응 약독화 생백신(cold-adapted, live-attenuated)을 비롯하여 DNA 백신 등 다양한 형태의 백신이 개발되고 있다. 그러나 인플루엔자 바이러스의 변이 특성상 백신 효능에 차질이 있거나 공급이 제한될 경우 차선책으로 인플루엔자 항바이러스제를 예방적 목적으로 사용할 수 있다. 특히, 인플루엔자의 고위험군에 속하거나 백신을 접종받을 수 없는 사람들이 인플루엔자 유행 기간에 예방목적으로 인플루엔자 항바이러스제를 사용할 수 있다. 최근 조류인플루엔자에 의한 인체감염 예방 등을 목적으로 oseltamivir와 같은 항바이러스제의 사용 빈도가 증가함에 따라 약제에 내성을 보이는 바이러스가 발생하고 있다.
  특히, 2008년 1월 노르웨이에서 oseltamivir에 내성을 가진 인플루엔자 A/H1형 바이러스의 발생을 보고한 이후 유럽, 미주, 서태평양 지역 등지에서 이러한 내성주 발생 보고가 계속 증가하는 추세를 보이고 있으며, 현재까지 전 세계 40개국에서 A/H1형 내성주가 보고되었다[1].
  질병관리본부 인플루엔자바이러스팀은 2002년부터 인플루엔자 항바이러스제 중 M2 억제제인 amantadine과 NA 억제제인 zanamivir 및 oseltamivir에 대한 내성 감시체계를 운영하여 국내 인플루엔자 바이러스 분리주에서의 약제 내성 양상을 모니터링하고 있다. 본 글에서는 2007-2008 절기 동안 국내에서 유행한 인플루엔자바이러스의 항바이러스제 내성주 발생 양상을 분석한 결과를 보고하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말
  1. 연구 방법
  1) 인플루엔자 바이러스 배양
  국내 유행 인플루엔자 바이러스에 대한 약제 내성 양상 조사를 위하여 2007-2008 절기 동안 분리된 인플루엔자 바이러스를 이용하였다. 2007-2008 절기 인플루엔자 바이러스 국내 분리주 대상 선정 시 통계적으로 유의한 자료를 확보하고자 주별, 지역별, 아형별을 고려한 무작위 표본 추출법을 적용하여 총 446주(A/H1 93주, A/H3 109주, B 244주)를 선정한 후 내성 양상을 분석하였다.
  인플루엔자 A형 바이러스 202주(A/H1 93주, A/H3 109주)는 M2 protein 억제제 및 NA 억제제 모두에 대한 내성 양상 분석에 사용하였고, 인플루엔자 B형 바이러스 244주는 NA 억제제 내성 양상 분석에만 사용하였다. 즉, M2 protein 억제제 내성 양상 조사 시에는 A/H1형 바이러스 93주 및 A/H3형 바이러스 109주(합계 202주)를 사용하였고,  NA 억제제인 oseltamivir 및 zanamivir에 대한 내성 양상 조사를 위해서는 A/H1형 바이러스 93주, A/H3형 바이러스 109주, B형 바이러스 244주 (합계 446주)를 사용하였다.
  본 연구에서 이용된 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포는 10% 우태아혈청(FBS)과 항생제(100U/ml penicillin-streptomycin)가 첨가된 Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하여 단층(monolayer)을 형성시킨 다음 제반 실험에 이용하였다.
  배양된 MDCK 세포에 trypsin이 첨가된 배지를 이용하여 인플루엔자 바이러스 분리주를 접종한 후 5% CO2, 35℃ 조건에서 배양하여 80% 정도 이상의 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)가 관찰되면, 이를 수확하여 원심분리(4℃, 10,000 rpm, 15min)하여 상층액과 세포침전물을 분리한 후 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

  2) 인플루엔자 항바이러스제
  현재 사용되고 있는 인플루엔자 항바이러스제 종류로는 M2 억제제인 amantadine과 rimantadine, NA 억제제인 zanamivir와 oseltamivir가 있다(Table 1). Amantadine과 rimantadine은 화학구조가 유사한 약제로 A형 인플루엔자 바이러스에만 특이적으로 작용한다. 국내에서는 amantadine이 현재 시판되고 있어 본 실험에는 Amantadine hydrochloride(Sigma, USA) 제품을 사용하였다.

  NA 억제제인 zanamivir와 oseltamivir는 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 모두에 대해 억제 효과가 있으며, 2000년 4월 zanamivir가 식품의약품안전청으로부터 허가를 받아 동년 9월부터 국내에서 시판되었으며, oseltamivir는 1년 후인 2001년 11월부터 발매가 시작되었다. 본 실험에는 Oseltamivir carboxylate (Roche, Switzerland) 및 Zanamivir(GlaxoSmithKline, UK)를 각각 생산업체로부터 공급받아 사용하였다.

  3) 항바이러스제 내성 검사방법
  인플루엔자 항바이러스제 내성은 표현형 분석법(phenotypic assay)과 유전형 분석법(genotypic assay)을 이용하여 확인하였다. M2 억제제에 대한 표현형 분석법의 경우, 항바이러스제를 농도별(0, 1, 10 ㎍/㎖)로 세포에 전처리한 후 37℃, 5% CO2로 유지된 배양기에서 30분간 배양하였다. 24 웰플레이트의 각 웰에 104-5 TCID50의 인플루엔자바이러스를 100 ㎕씩 접종한 후 0, 1, 10 ㎍/㎖의 농도로 제조된 amantadine을 접종용 배지에 넣어 35℃, 5% CO2로 유지된 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 세포 상층액에서 혈구응집반응(haemagglutination assay)으로 역가를 측정하여 약제 처리에 따른 바이러스 증식 억제 정도를 확인하였다.
  Neuraminidase 억제제의 경우, 세계보건기구 협력센터인 호주 인플루엔자 표준실험실(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)에서 제공하는 표준 실험법인 형광 NA억제법(Fluorometric Neuraminidase Inhibition Assay, WHO-025)을 사용하였다. NA 억제제의 농도가 0-30,000nM 되도록 준비하여 50㎕씩을 96 well black plate에 넣고 각 well에 인플루엔자바이러스를 50㎕씩 그리고 마지막 well은 대조로 1X AB 50㎕를 첨가한 후 상온에서 45분간 반응시켰다. MUNANA(methyl umbelliferone N-acetyl neuraminic acid) 기질을 50㎕씩 각 well에 첨가한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, 100㎕의 stop solution을 첨가한 반응을 정지시킨 후 360nm와 448nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Prism 4.0 프로그램을 이용하여 각각의 바이러스에 대한 NA 억제제 IC50를 구한 후, IC50 농도가 0.001 nM~15 nM(zanamivir) 및 0.001 nM~25 nM(oseltamivir)의 경우는 감수성주로, 43 nM~8020 nM(zanamivir 및 oseltamivir)의 경우는 내성주로 판정하였다.
  M2 억제제의 유전형 분석을 위해서는 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 유전자 중 amantadine 내성과 관련된 아미노산 변이(L26F, V27A, A30T, S31N,  G34E) 부위를 확인하였다. Neuraminidase 억제제에 대해서는 NA 유전자의 염기서열 분석을 통해 내성과 관련 있는 아미노산 부위(E119V, R152K, H274Y 및 R292K)에서의 변이 여부를 확인하였다.

  2. 연구결과
  1) M2 억제제(Amantadine)에 대한 내성 양상 
  2007-2008 인플루엔자 절기 동안 국내에서 분리 확인된 A/H1형 인플루엔자 바이러스 93주와 A/H3형 인플루엔자 바이러스 109주를 대상으로 M2 유전자에 대한 염기서열 분석을 수행하여, 내성 관련 부위인 아미노산 26, 27, 30, 31, 34의 변이 여부를 조사하였다. 그 결과 A/H1 93주 중 91주(97.8%)와 A/H3 109주 중 109주(100%)에서 M2 유전자 부위의 내성과 관련된 아미노산 변이가 관찰되었다(Table 2). M2 단백질에서 내성과 관련된 아미노산 L26F, V27A, A30T, S31N, G34E 부위를 관찰한 결과, 아미노산 26, 27, 30, 34에서는 아미노산 변이가 나타나지 않았으며, 아미노산 31 부위에서는 내성이 확인된 200주(A/H1 91주, A/H3 109주) 모두에서 Ser이 Asn으로 치환되어 M2 단백질 억제제 내성과 관련된 유전적인 변이를 확인하였다.

  인플루엔자 바이러스 분리주의 M2 유전자에 대한 염기서열 분석을 통해 M2 단백질 억제제 내성과 관련된 유전적인 변이를 확인한 후, 내성주 9주 및 감수성주 1주를 대상으로 amantadine 내성 표현형 결과와 비교하였다. Amantadine 농도별 약제 처리에 따른 바이러스 증식 억제 정도는 haemagglutination(HA) 역가를 측정하여 확인하였다. 그 결과 아미노산 31 부위에서 Ser에서 Asn으로의 변이가 관찰된 내성주는 HA titer가 거의 변화되지 않아 약제 처리로 인한 바이러스 증식은 영향을 받지 않았다. 반면, 아미노산 31 부위에서 아미노산 변이가 관찰되지 않은 감수성주는 약제 농도별 처리에 따라 바이러스 증식이 억제되어 HA 역가가 감소됨을 보여주었다(Table 3). 이 실험을 통해 M2 단백질 억제제 내성과 관련된 아미노산 변이(S31N) 결과와 약제 감수성 표현형 결과가 일치함을 확인하였다.

 2) Neuraminidase 억제제에 대한 내성 양상
  2007-2008 절기에 국내에서 분리 확인된 인플루엔자 A/H1형 바이러스 93주, A/H3형 109주와 B형 244주를 대상으로 NA 유전자에 대한 염기서열을 분석하였다. 이들 분리주의 염기 서열 및 아미노산 서열 분석을 통해 NA 억제제 내성 관련 부위에서의 변이(E119V, R152K, H274Y, R292K, N294S) 여부를 조사한 결과 이들 부위에서의 변이는 관찰되지 않았다.
  2007-2008 절기동안 국내에서 분리된 인플루엔자 A형 바이러스 중 223주(A/H1 50주, A/H3 50주, B 123주)를 대상으로 인플루엔자 치료제 중 하나인 NA 억제제(Zanamivir 및 Oseltamivir)에 대해 표현형 분석 방법인 fluorometric NA inhibition assay를 이용하여 50% 억제농도(50% Inhibitory Concentration, IC50)를 조사하였다. 그 결과 국내 인플루엔자 바이러스 A/H1형, A/H3형, B형 분리주의 zanamivir에 대한 IC50 값은 각각 0.001 nM-1.671 nM, 0.001 nM-0.971 nM, 0.215 nM-8.529 nM이었으며, oseltamivir에 대해서는 0.019 nM-1.816 nM, 0.001 nM-0.285 nM, 1.099 nM-5.321 nM이었다(Table 4). 이들 값은 모두 감수성주 범위(zanamivir; 0.001 nM-15 nM, oseltamivir; 0.001 nM-25 nM)내에 속해, 2007-2008 절기에 유행한 인플루엔자 바이러스 A/H1, A/H3, B형은 NA 억제제에 모두 감수성을 갖는 것으로 확인되었다.

Ⅲ. 맺음말

  미국 CDC의 사용 금지 권고[2-7]와 우리나라 식품의약품안전청의 사용 제한 권고가 있었던 amantadine에 비해 NA 억제제인 oseltamivir와 zanamivir는 내성주 발생 비율이 낮고 부작용이 적을 뿐 아니라, A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 모두에 억제 효과를 나타내기 때문에 인플루엔자 치료 및 예방에 많이 사용되고 있다[8]. 하지만 2008년 초 NA 억제제인 oseltamivir에 대한 A/H1형 내성주가 확인됨에 따라 Global Influenza Surveillance Network(GISN)을 중심으로 NA 억제제 내성주 감시 사업이 강화되고 있다. 우리나라도 이에 대한 중요성을 인식하고 2002년부터 항바이러스제 내성 감시체계를 통해 국내 분리주 일부에 대한 내성 여부를 조사해 왔다.
  본 조사를 통하여 2007-2008 절기 동안 국내 인플루엔자 바이러스 분리주 A/H1 및 A/H3의 amantadine 내성율이 각각 97.8%와 100%로 나타남에 따라 국내에서도 인플루엔자 치료제로서의 amantadine 사용이 제한되어야 할 것으로 생각된다. 그러나 2007-2008 절기에 유행했던 인플루엔자 바이러스 A/H1, A/H3, B형의 NA 억제제에 대한 내성 양상을 조사한 결과 모두 감수성을 유지하고 있음을 확인하였다.
  이와 같은 국내 인플루엔자 바이러스 내성주 분석 자료는 인플루엔자 환자 치료 및 대유행에 대비하여 효과적인 인플루엔자 치료제 사용 관련 정보를 제공하기 위한 목적으로 2008년 2월부터 국내 인플루엔자 표본감시체계 사이트
(http://dis.kdca.go.kr/influenza/)를 통하여 제공하고 있다. 또한 본 결과는 전 세계 인플루엔자 감시체계인 Global Influenza Surveillance Network(GISN)에 제공됨으로써 전 세계적인 인플루엔자 내성주 발생 양상 분석에 활용되고 있다.
  최근 빈번하게 발생하는 조류 인플루엔자로 인해 전 세계적으로 항바이러스제(특히 oseltamivir) 비축 및 사용이 증대되고 있으므로, 효과적인 인플루엔자 치료지침 확립 및 범유행 대비에 활용하기 위해 향후 검사 대상 확대 등 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제 내성주 감시체계를 보다 강화할 필요가 있다.

Ⅳ. 참고문헌
 1. World Health organization (WHO), 2008. Influenza A(H1N1) virus resistance to oseltamivir. 2008.08.20.
 2. Bright, R.A., Medina, M.J., Xu, X., et al., 2005. Incidence of adamantane resistance among influenza A (H3N2) viruses isolated worldwide
     from 1994 to 2005: a cause for concern. Lancet 366, 1175-1181.
 3. Bright, R.A., Shay, D.K., Shu, B., et al., 2006. Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005-2006
     influenza season in the United States. JAMA 295, 891-894.
 4. Deyde, V.M., Xu, X., Bright, R.A., et al., 2007. Surveillance of resistance to adamantanes among influenza A(H3N2) and A(H1N1) viruses
     isolated worldwide. JID 196, 249257.
 5. Hayden, F.G., 2006. Antiviral resistance in influenza viruses implications for management and pandemic response. N. Engl. J. Med. 354,
     785-788.
 6. Wwinstock, D.M. and Zuccotti, G. 2006. Adamantane resistance in influenza A. JAMA 295, 934-936.
 7. Centre for Disease Control Prevention (CDC), 2006. High levels of adamantane resistance among influenza A (H3N2) viruses and interim
     guidelines for use of antiviral agents United States, 2005/06 influenza season. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 55, 44-46.
 8. McKimm-Breschkin, J.L., 2000. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors-a review. Antiviral Res. 47, 1-17.