A, B, E 및 F형 보툴리눔균 동시 검출용
semi-nested PCR 기법 개발 및 환경검체에의 적용

Development of enrichment semi-nested PCR for Clostridium botulinum types A, B, E, and F and
its applications to Korean environmental samples

질병관리본부 감염병센터 병원체방어연구팀  

Ⅰ. 들어가는 말
  보툴리눔균(Clostridium botulinum ; 이하 C. botulinum)은 절대혐기성의 포자생성균으로 치명적인 신경독소인 보툴리눔 독소(botulinum neurotoxin ; 이하 BoNT)를 분비한다. 보툴리눔 독소는 자연계에서 생성되는 가장 강력한 독소로 마비성 질환인 보툴리눔 중독증(botulism)을 야기한다. 보툴리눔 중독증은 안면마비로 시작하여 하행성 양측성 마비로 진행되며, 심한 경우 호흡근 마비에 의한 사망을 유발한다[1]. 보툴리눔 독소는 항원적 특성에 따라 A-G까지의 7가지 독소형으로 구분되며, 이 중 A, B, E 및 F형은 사람에서, C와 D형은 동물에서 보툴리눔 중독증을 유발하는 것으로 알려져 있다[2,3,4,5].
 C. botulinum은 포자 상태로 토양이나 해양침전물과 같은 자연환경에 흔히 존재하며, 음식물이나 상처부위 등에 오염될 경우 보툴리눔 중독증을 일으킨다. 따라서 환경에서의 C. botulinum 분포에 대한 정보는 보툴리눔 중독증 발생 위험도를 평가하는 중요한 척도가 될 수 있다. 외국의 경우 물고기나 생육 등의 식재료 뿐만 아니라 토양, 해변가 침전물 및 분변 등의 환경 내 C. botulinum에 대한 조사 연구가 많이 수행되고 있으며[6,7,8], 이는 대부분 in vivo mouse bioassay법을 이용하여 보툴리눔균을 탐지하기 때문에 약 5-10일 정도의 기간이 소요되고 있다. Mouse bioassay법의 경우, 높은 민감도 및 특이도를 보유하고 있으나 결과를 얻기까지 오랜 시간이 소요된다는 단점이 있어 많은 연구자들이 보툴리눔균 탐지를 위한 PCR 기법을 개발하여 왔다[6,7,8]. 그러나 현재까지 사람에서 보툴리눔 중독증을 야기할 수 있는 4가지 독소형인 보툴리눔 독소 A, B, E 및 F형을 하나의 PCR primer set를 이용하여 동시에 탐지할 수 있는 기술에 대한 연구 사례는 보고된 바가 없었다. 이에 본 연구진은 semi-nested PCR 기법을 개발하여 C. botulinum A, B, E 및 F형을 동시에 탐지하였으며, 이를 국내 환경검체에 적용하여 의미있는 결과를 확보하였다..

Ⅱ. 몸 말
  1. 재료 및 방법
  1) Semi-nested PCR을 위한 프라이머 제작
  GenBank 유전자 데이터베이스에 등재된 14개의 보툴리눔 A, B, E 및 F형 독소 유전자 염기서열 분석을 통해 A, B, E 및 F형 독소 유전자의 공통 염기서열 부분에 대한 primer set를 제작하였다. 또한 A, B, E 및 F형 독소 유전자에 각각 특이적인 4개의 내부 프라이머(nested primer)를 디자인하였다. 보툴리눔 독소 유전자 염기서열 분석을 위하여 사용된 GenBank 부여번호(accession number)는 다음과 같다. 즉, C. botulinum A형의 경우 M30196, X52066 및 X73423, C. botulinum B형의 경우 AB084152, AF295926, M81186, X71343 및 X87849, C. botulinum E형의 경우 X62089, X62683 및 ZB082519, C. btoulinum F형의 경우 L35496, M92906 및 X81714이 사용되었다(Table 1).

  C. botulinum 탐지를 위한 환경검체는 전라남도 해남군 당두리에 위치한 영암호 주변에서 2004년 10월에 총 44개의 토양침전물을 채취하였다. 호수 주변을 대략 500m 간격의 5개 구역으로 구분하였으며 각 샘플은 10m 정도의 간격을 두고 채취하였다. 토양검체는 지표면으로부터 10-30cm의 깊이에서 약 100g을 수집한 다음 냉장상태로 가능한 빨리 국립보건연구원으로 수송하여 검사를 실시할 때까지 -70℃에 보관하였다. 각 검체는 Figure 1에서 제시된 프로토콜 순서에 따라 처리한 후 본 연구에서 확립한 semi-nested PCR 기법에 따라 C. botulinum 독소 유전자 탐지를 수행하였다.

  2) Semi-nested PCR 기법 개발 및 검증
  Semi-nested PCR은 2회의 증폭단계로 디자인되었다. 먼저 primer BT-F와 BT-R을 이용하여 증폭한 후 얻은 PCR 증폭산물을 주형으로 사용하여 primer BT-F 및 BT-A Nested R, BT-B Nested R, BT-E Nested R 및 BT-F Nested R로 구성된 4개의 내부 프라이머와 함께 2차 PCR을 수행하였다. PCR 혼합액은 10㎍의 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 포함하여 총 25㎕가 되도록 하였으며, 증폭조건은 94℃에서 5분간 열변성(denaturation) 후, 다시 94℃에서 1분간 열변성(denaturation), 55℃에서 1분간 결합(annealing), 72℃에서 1.5분간 합성(extension)시키는 과정을 35회 반복한 다음 72℃에서 7분간 최종 합성(final extension)을 수행하였다. 2차 PCR의 조건은 50℃에서 1분간 결합 및 72℃에서 1분간 합성을 수행하는 것을 제외하고는 1차 PCR과 동일하였다. 이상의 반응 조건은 C. botulinum으로부터 정제한 genomic DNA를 이용하여 최적화하였으며 2.0% agarose gel에서 전기영동하여 가시화하였다.
 새롭게 개발된 semi-nested PCR 기법은 민감도, 특이도 및 회수도 확인을 통해 검증하였다. 특이도는 C. botulinum 10주, 보툴리눔균을 제외한 다른 Clostridium spp. 3주, 및 non-Clostridium strain 34주에 대하여 semi-nested PCR을 수행함으로써 확인하였다. 특이도 조사를 위하여 모든 균주는 TYG broth 혹은 BHI broth에 배양한 후, 배양액으로부터 genomic DNA를 취한 후 semi-nested PCR을 수행하였다. C. botulinum A형(ATCC3502), B형(ATCC439), E형(ATCC9564) 및 F형(ATCC23387)으로부터 각각 독소형별 포자를 제조한 후, 직접 10배 단계 희석하거나 희석한 포자를 TYG broth에 배양하여 semi-nested PCR을 수행하는 방법으로 민감도를 검증하였다. 회수도는 10배 단계 희석한 포자를 3.0g의 토양 침전물에 인위적으로 접종한 후 직접 혹은 TYG broth에 배양하여 semi-nested PCR을 수행함으로써 확인하였다.

  3) C. botulinum 분리 동정 및 독소유전자(bont gene) 염기서열 분석
  C. botulinum은 Austin and Blanchfield[9] 및 미국 질병통제센터(CDC)[1]에서 기술한 방법에 의해 분리하였다. 즉, 모든 균 배양액을 고체 배지에서 35℃에서 40 시간 동안 배양한 후, C. botulinum으로 의심되는 균 집락을 여러 개 선택하여 TYG broth에 각각 순수 배양하였다. 순수 배양액을 원심분리하여 침전물은 semi-nested PCR에, 상층액은 mouse bioassay에 사용함으로써 C. botulinum을 동정하였다. C. botulinum 분리주의 독소 유전자 염기서열은 보툴리눔 B형 독소 유전자(bontb gene)에 대한 PCR을 수행한 후 ABI-310 DNA sequencer를 사용하여 결정하였으며, DNASTAR 소프트웨어 패키지의 MEGALIGN으로 분석하였다. 본 연구에서 확인된 염기서열 데이터는 DDBJ/EMBL/GenBank 유전자 염기서열 데이터베이스에 제출하여 부여번호 DQ417353과 DQ417354를 받았다.

  2. 연구결과
  1) C. botulinum A, B, E 및 F형의 동시 탐지를 위한 Semi-nested PCR 기법 개발
  C. botulinum A, B, E 및 F형으로부터 각각 정제한 genomic DNA를 이용하여 semi-nested PCR을 실시한 결과, 1차 증폭 단계에서는 C. botulinum A, B, E 및 F형에 대하여 1,033-1,054 bp에서 예상된 크기의 증폭산물을 각각 확인하였으며(Figure 2A), 2차 증폭 단계에서는 agarose gel에서의 전기영동을 통해 각 독소형간에 증폭산물의 크기를 50 bp 이상 다르게 함으로써 독소형을 명확히 구분할 수 있도록 하였다
 (A형의 경우 462 bp, B형의 경우 256 bp, E형의 경우 633 bp, F형의 경우 576 bp : Figure 2B).

 새로 개발한 semi-nested PCR을 검증하기 위하여 특이도, 민감도 및 회수도를 조사하였으며, 다양한 균종에 대하여 semi-nested PCR을 적용하여 본 결과 C. botulinum strain에 대하여만 bont gene의 증폭산물을 확인하였다. 또한 C. botulinum 탐지 최소량을 결정하기 위해 semi-nested PCR을 실시한 결과, A, B, E 및 F형 균주 포자에 대하여 각각 102, 106, 103, 103개의 포자까지 탐지가 가능하였으며, 각 균주의 포자 배양액에 대하여는 각각 100, 101, 101, 101개의 포자까지 탐지되었다. 추가적으로 토양에 오염되어 있는 C. botulinum의 탐지 최소량을 결정하기 위해 semi-nested PCR을 실시한 결과, A, B, E 및 F형 균주 포자에 대하여 1차 PCR에서는 각각 103, 104, 104, 103개의 포자까지 탐지가 가능하였으며, 2차 PCR에서는 각각 101, 103, 103, 103개의 포자까지 탐지가 가능함을 확인하였다.

  2) 국내 토양 침전물에서의 C. botulinum 탐지
  해남 당두리 영암호에서 수집한 토양 침전물 44건을 Figure 1의 과정에 따라 C. botulinum의 존재 유무 확인 및 균 분리 동정을 실시한 결과, 11.4%(5/44)의 샘플에서 B형에 대한 양성 결과를 확인하였으며(Figure 3), 양성 검체로부터 균 분리를 시도한 결과, 2개의 구역에서 각각 1 종씩 총 2주의 C. botulinum B형 proteolytic strain을 분리하였다. 분리구역(A-E)에 따른 결과는 Table 2에 제시된 바와 같다. 보툴리눔 B형 분리주는 최종적으로 16s rRNA sequencing을 통해 동정하였으며, 이를 검체채취구역번호에 따라 각각 C. botulinum Yeongam-ho A3와 D7으로 명명하였다.

  3) C. botulinum 토양 분리주의 독소 유전자 분석
  C. botulinum Yeongam-ho A3 및 D7로부터 확인된 bontb gene은 3,876 bp로 구성되어 있었으며, G+C 함량은 각각 25.08%와 25.15%로 확인되었다. 두 유전자의 뉴클레오타이드 염기서열 및 이로부터 추정된 아미노산 염기서열을 DDBJ/ EMBL/GenBank 데이터베이스(부여번호 AB084152, AF295926, M81186)에 보고된 염기서열과 비교 분석한 결과, AB084152(일본 영아 보툴리눔 중독증 임상분리주의 유전자 염기서열)와 가장 높은 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다(Table 3). 또한 아미노산 염기서열을 비교 분석한 결과, 독소의 경쇄 부위(light chain)보다 중쇄 부위(heavy chain)를 encoding하는 부위에 더 많은 변이가 존재하는 것으로 나타났다.

Ⅲ. 맺음말

  국내의 보툴리눔 중독증은 2003년 첫 집단발생 보고 이후 간헐적으로 발생이 보고되고 있어 국내 역시 C. botulinum이 자연환경에 상재해 있을 것으로 추정되었다[10]. 따라서 본 연구에서는 국내 환경검체로부터 C. botulinum을 탐지하기 위한 방법으로 semi-nested PCR을 개발·적용하였으며, 이 방법은 사람에서 보툴리눔 중독증을 야기할 수 있는 독소형인 보툴리눔 A, B, E 및 F형의 독소유전자를 한 set의 primer로 동시에 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 2차 PCR에 의해 독소형 구분 또한 가능함을 확인하였다.
 새로 개발한 semi-nested PCR 기법의 환경 검체에의 적용가능성을 확인하기 위하여 전남 해남군 당두리에 위치해 있는 영암호에서 채취한 토양침전물을 직접 적용하여 본 결과 C. botulinum 양성률은 약 11%로 나타났으며, PCR toxinotyping에 의해 영암호의 토양에는 C. botulinum type B 균주가 가장 일반적으로 존재하고 있는 것으로 확인되었다. 영암호는 바닷가에 둑을 쌓아 형성된 인공호수로서 2004년에 이 지역에서 심각한 조류 보툴리눔 중독증이 집단 발생한 바 있다. B형 보툴리눔 독소가 일반적으로 조류에서 보툴리눔 중독증을 야기하는 것으로 보고된 독소형이 아니라 할지라도 이 지역이 C. botulinum이 상재하기에 좋은 조건을 갖추고 있는 것으로 ���정된다[5,11,12,13].
 연구진은 또한 토양 검체로부터 C. botulinum을 분리·동정하기 위한 프로토콜을 개발하여 2주의 C. botulinum B형을 확보하였으며, 이는 국내 환경에서 분리 동정한 C. botulinum에 대한 첫 번째 보고인 것으로 생각된다. 토양으로부터 분리한 2주의 C. botulinum에 대한 bontb gene의 전체 염기서열을 분석한 결과, C. botulinum Yeongam-ho A3와 D7 균주의 독소 유전자 염기서열 간에 다소 차이를 나타냄으로써 두 분리주가 서로 구별되는 개체임을 확인하였다. 또한 이전에 보고된 bontb 유전자와의 염기서열상의 상동성을 비교한 결과 일본에서 보고된 영아 보툴리눔 중독증 원인체와 가장 유사한 것으로 확인되었으며, 이는 지리학적 근접성과 관련이 있을 것으로 보인다. 아미노산 염기서열 분석을 통해 보툴리눔 독소 유전자의 중쇄 부분(heavy chain)에서 많은 변이가 있음을 확인하였으며, 이는 보툴리눔 독소의 중쇄 부분이 경쇄 부분보다 유연성이 높은 유전적 부위임을 의미한다.
 결론적으로, 본 연구를 통해 연구진은 semi-nested PCR을 이용한 환경에서의 C. botulinum 분리 동정법을 확립하고, 이를 국내 환경 검체에 직접 적용함으로써 본 방법이 환경 검체로부터 C. botulinum을 분리하는 데 매우 유용함을 증명하였다. 따라서 본 연구를 통해 개발된 semi-nested PCR 기법은 앞으로 국내에서의 C. botulinum에 대한 환경 조사연구 뿐만 아니라 국가 병원체 자원으로서 C. botulinum을 확보하는 데 있어서도 매우 유용하게 활용할 수 있을 것으로  기대된다. 

Ⅳ. 참고문헌
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※ 이상의 연구 내용은 한국분자ㆍ세포생물학회지인 [Molecules and Cells]의 [24권 3호]에 게재된 논문 “Development of enrichment semi-nested PCR for Clostridium botulinum types A, B, E, and F and its application to Korean environmental samples”를 국문으로 번역한 것으로, 『한국분자ㆍ세포생물학회 학회지 편집위원회』의 허가에 따라 [주간건강과질병]에 게재하였습니다.