국내에서 분리되는 임균의 항균제 내성

Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae isolated from Korea

연세대학교 의과대학 진단검사의학교실, 세균내성연구소   
국립보건연구원 감염병센터 약제내성팀  

Ⅰ. 들어가는 말
  임균은 그람음성 쌍구균으로 임질, 요도염 등의 다양한 감염 질환을 일으킨다. 임균 감염증은 오랜 역사를 가진 질환으로 선진국에서는 개인위생의 개선으로 인해 감염 건수가 감소하는 추세이다. 질병관리본부의 보고에 의하면 우리나라의 임질 보고건수는 2001년 18,520건에서 2006년에는 4,050건으로 감소하였다[1]. 그러나 근래에 감염되는 환자의 대부분이 성적으로 활발한 20대에서 30대 초반이며, 국민건강심사평가원 보고에서는 연간 2만 건 이상의 임균 감염 환자가 치료를 받는 것으로 나타나, 국내의 임균 감염은 아직도 적지 않을 것으로 판단된다.
  과거 임균은 페니실린 G(penicillin G)를 포함한 여러 가지 항균제에 감수성을 가지고 있어 치료에 어려움이 없었으나, 근래에는 다제 내성 임균이 증가하여 문제가 되고 있다. 1979년 페니실린 분해효소(penicillinase) 생성주(penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae ; 이하 PPNG)가 국내에서 처음 분리된 이후, 그 비율은 1991-1992년의 약 50%에서 1999년에는 84%까지 급격히 증가하여 페니실린 G는 임균 감염의 치료제로 사용하기 어렵게 되었다. 플루오로퀴놀론(Fluoroquinolone)은 대부분의 임균에 항균력이 있고, 요에 고농도로 농축되며, 경구 투여가 가능하다는 장점이 있어 PPNG의 증가 이후 임균 감염의 치료제로 널리 사용되어졌다. 그러나 1994년 플루오로퀴놀론에 감수성이 저하된 임균이 최초로 보고되었고[2], 근래에는 이 약제에 고도 내성을 가진 임균까지도 보고되었다. 2004년에 용 등이 보고한 바에 의하면 국내에서 분리되는 임균의 플루오로퀴놀론 내성은 최근 급격히 증가하여, 2000년에 수집한 190주의 임균 중 172주(90%)가 플루오로퀴놀론에 중등도 내성 혹은 내성을 나타내 국내의 플루오로퀴놀론 내성이 심각함을 알 수 있었다[3]. 플루오로퀴놀론제에 대한 내성은 국외에서도 심각하여 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에서는 2000년 이후 임균 감염증의 치료 지침에서 동남아시아와 하와이, 뉴욕 등의 미국 일부 지역에서 발생한 임균 감염증 치료에 플루오로퀴놀론을 사용하지 말 것을 권고하였고, 2007년도에는 모든 임균 감염증 환자에서 플루오로퀴놀론 사용을 제한하였다.
  그러나 본 연구팀이 2006년에 수행한 연구에 의하면, 국내에서 분리된 임균의 quinolone resistant determining region에서 기존의 보고와는 다른 새로운 변이가 발견되어 플루오로퀴놀론제로 인한 선택 압력(selection pressure)은 지속되고 있는 것으로 생각되며 1차 또는 2차 의료 기관에서 임균 감염증 치료에 사용하는 항균제의 정확한 조사가 필요할 것으로 생각되었다. 한편, 세프트리악손(ceftriaxone)은 제3세대 세팔로스포린계(cephalosporin) 항균제이며 대부분의 임균이 이 약제에 감수성을 보여 임균 감염치료에 효과적인 약제이긴 하나 주사제로만 사용이 가능하다는 단점이 있다. 1991년 Handsfield 등은 임균 감염증 환자 333명을 대상으로 경구용 세픽심(cefixime)을 투여 받은 군과 근육주사로 세프트리악손을 투여 받은 환자군의 치료 효과를 비교하여, 세픽심이 세프트리악손과 동일한 치료 효과를 갖고 있고(치료율: 세픽심 400mg, 96%; 세픽심 800mg, 98%; 세프트리악손 98%), 주사제의 불편함 없이 1회의 경구 투여로 임균을 치료할 수 있음을 보고하였다[4]. 그러나 Ameyama 등은 일부 임균의 경우에서 penicillin-binding protein (PBP)2 유전자인 penA의 모자이크형(mosaicism)에 의해 세픽심에 대한 감수성이 저하된 균주를 보고하였고[5], 2007년에는 유전적 다양성(Genetic polymorphism)에 의해 세프트리악손에 대한 감수성이 저하된 균주도 보고되었다[6]. 플루오로퀴놀론 내성으로 인해 2000년대 초반부터 세팔로스포린계 항균제 사용이 증가한 국내의 환경을 고려하면 이에 대한 감시 및 연구가 필요하다고 하겠다.
  이에 본 연구에서는 전국 주요 지역을 대상으로 특수 직업여성 및 환자로부터 임균을 분리 수집하여 플루오로퀴놀론과 세팔로스포린계 항균제를 포함한 주요 항균제에 대한 내성 양상 및 주요 내성 기전을 분석하고, 일부 내성 세균의 분자역학적 성상 등을 규명하여 내성균의 확산을 막기 위한 중요한 자료를 제공하고자 하였다.

Ⅱ. 몸 말
  1. 연구방법
   국내 주요 지역을 거점으로 하는 다기관 연구 체계를 구축하여 보건소 및 의료기관을 대상으로 균주를 수집하였다. 2006년도에 보고된 임균 감염 건수를 분석하여, 임균의 분리 건수가 많은 보건소를 선정하여 균주 수집을 의뢰하였고, 전국 의원과 병원 중 임균 감염 보고가 많은 기관을 대상으로 균주 수집 체계를 구축하였다. 임균의 배양이 불가능한 1차 의료기관은 내원한 환자 중에서 임상적으로 임균 감염이 의심되는 환자의 검체를 수집하고, 연세의대 세균내성 연구소에서 배양하여 균주를 수집하였으며, 임균 배양이 가능한 의료기관과 임상검사센터에서는 분리된 균주를 수집하였다. 수집한 균주는 연세의대 세균내성 연구소에서 균종 확인, 항균제 감수성 시험, 항균제 내성 기전 규명, 분자역학적 성상 등의 연구를 수행하였다.

  2. 연구내용
   1) 연구 대상
    2007-2008년에 전국 각 지역에 위치한 1차, 2차 및 3차 병원 및 민간검사센터 2개 기관에서 일반 환자 분리 임균과 전국 5개 지역에 위치한 보건소로 의뢰된 특수직업 여성 분리 임균을 수집하였다. 특수 직업여성에서 임균을 수집하기 위한 보건소는 전염병 표본감시 자료 분석을 통해 임질 발생 보고가 많은 상위 10개 보건소를 1차로 선정하고, 10개 보건소의 지리적 분포와 임균 수집 및 배양 조건 등을 평가하여 최종적으로 5개의 보건소를 선택하였다. 임균 분리를 위한 선택배지는 modified Thayer-Martin 배지(BBL, Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA)를 사용하였고, 그람염색 후 현미경 관찰로 그람음성 쌍구균을 확인하는 방법으로 균종을 동정하였으며, 필요에 따라서 상품화된 키트를 이용하였다.

   2) 항균제 감수성 시험
   (1) 디스크 확산법
   시험 균주를 Mueller-Hinton broth에 풀어서 McFarland의 제 0.5관 탁도에 맞춘 후, 세균 부유액을 GC agar base(BBL)에 1% 헤모글로빈과 1% IsoVitaleX(BBL)를 첨가하여 만든 한천에 접종하고 시험 항균제 디스크(penicillin G, tetracycline, ceftriaxone, spectinomycin, fluoroquinolone, nalidixic acid)를 놓은 후 35℃, 5% CO2 항온기에 24시간 배양 후 Clinical & Laboratory Standards Institute(CLSI) 기준에 따라 판독하였다.
   (2) 한천 희석법
   동결 보관 균주를 초콜릿 한천에 접종한 후 양초단지에 넣어 35℃, 24-48시간 배양한 후, Mueller-Hinton broth에 풀어서 104 CFU/mL으로 희석하였다. GC agar base(BBL)에 1% 헤모글로빈과 1% IsoVitaleX(BBL)를 첨가하고, 규정된 희석액으로 녹인 항균제를 넣어 2배수 단계 희석된 농도가 되도록 평판을 만들었다. 세균부유액을 Steers’replicator(Craft Machine Inc., Woodline, PA, USA)를 써서 배지에 접종하고 35℃, 5% CO2 항온기에 24시간 배양 후 세균의 증식을 관찰하였다. 세균의 증식을 완전히 억제시킨 최소한의 농도를 최소억제농도(minimal inhibitory concentration ; 이하 MIC)로 정하였다. 결과의 정도관리를 위해서 N. gonorrhoeae ATCC 49226을 함께 시험하였다.
   (3) β-lactamase 생성시험
   Chromogenic cephalosporin 법인 cefinase 디스크(BBL)로 시험하여, 노란색이 분홍색으로 변하면 양성으로 판정하였다.

  3) 임균 감염의 항균제 사용 현황 조사
  국내의 임균 발생 현황 및 임균에 대한 항균제의 선택압력(selection pressure)을 평가하기 위해 2006-2007년에 전국 의료기관에서 임균 감염으로 진단받은 환자의 수와 임균 감염으로 진단된 환자에서 처방된 항균제의 종류 및 사용량을 건강보험심사평가원의 협조를 얻어 분석하였다.

  4) 주요 항균제 내성 기전 규명
   (1) 플루오로퀴놀론 내성 기전
   플루오로퀴놀론에 대해 고도 내성, 중간 내성 및 감수성을 갖는 임균의 gyrA와 parC 유전자의 변이를 규명하기 위해 quinolone resistance-determining region(이하 QRDR)의 유전자 염기서열을 분석하였다[3].
   (2) 세팔로스포린 내성 기전 
   균 집락을 증류수에 풀고 가열추출법(heat extraction)으로 template DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 PBP 2의 모자이크형을 분석하기 위해 penA 유전자 전체를 세부분으로 나누어 각각 primer set를 사용하여 PCR을 시행하였다. PCR 산물은 전기영동한 후 DNA 추출 키트를 사용하여 각 primer set에 적합한 크기의 PCR 산물을 추출한 후 염기서열을 분석하였다[7].

   5) 내성균의 분자역학적 성상 규명
   국내에서 분리되는 항균제 내성 임균의 유전적인 연관성 및 전파 양상을 규명하기 위해 Birren과 Lai의 방법을 변형하여 유전자 지문분석법(Pulsed-field gel electrophoresis ; 이하 PFGE)을 시행하였다[8].

  3. 연구결과
  1) 균주 수집
   2007년에 68주의 임균을 수집하였다. 2006년도에 수집된 임균은 보건소에 내원한 특수직업여성, 2차 또는 3차 병원에 내원한 일반 환자 및 1차 의료기관에 내원한 환자의 순으로 분리되었으나, 2007년도에는 일반 환자로부터 분리된 임균이 특수 직업여성에서 분리된 것보다 많았으며, 1차 의료기관에서 분리된 임균이 34주(50%)를 차지하였다. 보건소에 내원한 특수 직업여성에서 25주의 임균을 수집하였으며, 지역적으로는 서울 14주, 수원 1주, 원주 5주 및 광주 5주이었다. 일반 환자로부터는 수집된 43주의 임균 중 34주가 1차 의원 및 임상검사센터로부터 분리되었으며, 2차 및 3차 의료기관으로부터는 9주를 수집하였고, 지역적으로는 서울 26주, 경기 17주, 강원 6주, 대전 6주, 광주 5주 및 기타 지역이 8주였다. 

  2) 항균제 감수성
   (1) 디스크 확산법
   페니실린 G에 감수성을 보인 균주가 1주(1%) 있었으며, 중등도 내성을 나타낸 균주가 27주(40%)였고, 40주(59%)는 내성을 가지고 있었다. PPNG는 10주(15%)로 나타났다. 세프트리악손과 스펙티노마이신(Spectinomycin)에 내성을 가진 균주는 없었다. 테트라사이클린(Tetracycline)에 감수성을 나타낸 균주가 3주(4%)였으며, 내성을 보인 균주는 60주(88%)였고, 고도 내성균주인 TRNG는 12주(18%)였다. 시프로플록사신(Ciprofloxacin)에 대해서는 44주(68%)가 내성을 가지고 있었으며, 13주(19%)는 중등도 내성을 보였고, 11주(16%)는 감수성이 있는 것으로 나타났다. 날리딕산(Nalidixic acid)에 대해 감수성을 가진 균주는 15주(22%)였으며, 53주(78%)는 내성 균주였다.

  (2) 한천 희석법
페니실린 G의 MIC 범위는 0.12-128<μg/mL이었고, MIC50은 2μg/mL, MIC90은 128μg/mL로, 페니실린에 감수성을 보인 균주는 없었으나, 중등도 내성을 나타낸 균주의 비율은 2006년의 23%에서 2007년에는 49%로 증가하였다. 세프트리악손에 감수성이 저하된 균주는 없었으나 세픽심의 MIC가 1μg/mL로 비감수성을 나타낸 균주가 1주 있었다. 세프트리악손과 세픽심의 MIC90이 각각 0.12μg/mL와 0.25μg/mL으로, 2006년 분리주의 0.06μg/mL 및 0.12μg/mL 보다 2배 상승하였으며, 세픽심의 MIC가 ≥0.06μg/mL인 균주의 비율은 2003년의 40%에서 2007년에는 52%로 증가하였다. 테트라사이클린에 감수성을 나타낸 균주는 3주(4%)였으며, MIC50과 MIC90은 각각 2μg/mL과 32μg/mL이었고, TRNG는 12주(18%)가 분리되어 2006년의 7%에 비해 증가하였다. 시프로플록사신의 MIC 범위는 ≤0.008-32μg/mL이었고, MIC50과 MIC90은 각각 8μg/mL과 16μg/mL이었으며 내성 균주의 비율이 2006년의 87%에서 2007년에는 67%로 감소하였다. 스펙티노마이신의 MIC 범위는 16-32μg/mL이었고 MIC50과 MIC90은 모두 32μg/mL이었으며, 내성 균주는 없었다.

   3) 임균 감염증 치료에 사용된 항균제 현황
   국내의 임균 발생 현황 및 임균에 대한 항균제의 선택압력(selection pressure)을 평가하기 위해 2002-2006년 동안 전국 의료기관에서 임균 감염으로 진단받은 환자의 수와 임균 감염으로 진단된 환자에서 처방된 항균제의 종류 및 사용현황을 건강보험심사평가원의 협조를 얻어 분석하였다. 임균으로 치료받은 환자의 수는 2002년 50,305명이었으나 이후 감소하기 시작하여 2006년에는 19,762명이었으며, 임균 감염으로 진단받은 환자의 95%가 1차 의료기관에서 진단 및 치료를 받은 것으로 분석되었다. 주로 사용된 치료 항균제는 스펙티노마이신이었으나, 근래에 세팔로스포린계, 특히 세프트리악손의 사용이 증가하였다. 플루오로퀴놀론 처방 비율은 2002년도의 37%에서 2006년 25%까지 감소하였으며 오플록사신(ofloxacin)이 98%를 차지하였다. 그러나 국내 분리 임균의 높은 플루오로퀴놀론 내성율에도 불구하고 임균 감염 환자 4명 중 1명이 플루오로퀴놀론으로 치료받고 있어 이에 대한 검토가 필요할 것으로 보인다.

   4) 플루오로퀴놀론 내성 기전 규명
   2007년에 수집한 균주 중, 시프로플록사신에 대해 감수성이 저하된 56주의 QRDR 부위에 대한 유전자 변이 여부를 분석한 결과, 시프로플록사신에 대한 감수성이 저하되어 있는 모든 균주에서 QRDR 부위의 변이가 관찰되었다. 가장 흔한 변이형은 GyrA의 91번 아미노산이 serine에서 phenylalanine으로, 95번 아미노산이 aspartic acid에서 glycine으로, 그리고 ParC의 87번 아미노산이 serine에서 arginine으로 변화된 것으로 시프로플록사신 MIC가 4μg/mL 이상인 균주 중 35주에서 확인되었다. 이번 연구에서 관찰된 변이형 중에서 GyrA의 91번 아미노산이 phenylalanine으로, 95번 아미노산이 glycine으로, ParC의 85번 아미노산이 aspartic acid로 87번 아미노산이 arginine으로 변화된 유형과, GyrA의 91번 아미노산이 phenylalanine으로, 95번 아미노산이 glutamic acid로 ParC의 86번 아미노산이 asparagine으로 변화된 2개의 유형은 국내에서 분리된 기존의 임균에서는 보고되지 않은 새로운 유형이었다[3].

   5) Penicillin-binding protein(PBP) 모자이크형 분석
   세픽심에 대한 MIC가 0.06-0.25μg/mL로 내성 기준에 가까운 임균 25주에 대한 penA 유전자 염기서열 분석을 통해 penA 유전자의 모자이크형을 확인하였다. PBP2의 아미노산 서열에서 모자이크형이 관찰되지 않은 2주를 제외한 23주 모두에서 345번 위치에 aspartic acid 삽입, 504번 위치에서 phenylalanine이 leucine으로, 510번 위치에서 alanine이 valine으로, 516번 위치에서 alanine이 glycine으로 변화된 것을 확인할 수 있었다. 504번과 510번 아미노산의 변화는 N. perflava,  N. polysaccharea, N. cinerea의 염기서열과 동일하게 변화된 것이었고, 516번 아미노산의 변화는 N. polysaccharea의 염기서열과 일치하였다. 또한 501번 위치의 alanine, 542번의 glycine 및 551번의 proline이 흔하게 변화되는 위치였다. PBP2의 아미노산 서열 모자이크형 유형 중 가장 흔한 것은 504, 510, 516 및 542번 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 변화된 것으로서 9주가 여기에 속하였고, 이 중 6주는 β-lactamase 생성 균주였다. 다음으로 흔한 것은 501, 504, 510, 516 및 551번 위치의 아미노산이 변화된 것으로 8주가 여기에 속했다. 2주에서는 아미노산의 변화가 전혀 관찰되지 않았는데, 이들 균주에서의 세팔로스포린계 항균제에 대한 감수성 저하는 efflux pump나 PBP1의 변이 등과 관련이 있을 것으로 추정된다. 

   6) 유전자 지문 분석법(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)
   수집한 균주의 분자역학적 연관성을 규명하기 위하여 PFGE 분석을 시행하였다. 2007년도에 수집한 임균은 25개 형 및 19개 아형으로 분류할 수 있었으며, 일부 균주에서는 2006년과 마찬가지로 일반 환자와 특수 직업여성 분리주에서 동일한 PFGE형을 보였다. PFGE형은 전반적으로 다양하였으나 A형은 서울과 인천 지역에서 분리되었으며, 페니실린, 세프트리악손 및 세픽심에 대한 MIC 값이 전반적으로 낮았다. F형은 모두 페니실린 분해효소를 생성하는 PPNG였으며, 시프로플록사신에 대한 MIC는 0.5-2μg/mL로 높지 않았다. K형은 페니실린, 세프트리악손, 세픽심 및 시프로플록사신에 대한 MIC는 낮았으나 테트라사이클린의 MIC가 32-64μg/mL로 매우 높은 특징을 보였다. R형은 시프로플록사신에 대한 MIC가 4-32μg/mL으로 높았다.

Ⅲ. 맺음말

  임균에 의한 감염증은 근래에 점차 감소하고 있으나 아직도 연간 2만 건 이상의 의료급여 청구가 발생하고 있는 주요 감염 질환이다. 근래에 발생하는 임균 감염은 3가지 이상의 항균제에 동시에 내성을 가지는 다제 내성 균주에 의한 감염이 흔하며, 국내에서 분리되는 임균은 대부분 페니실린 G, 테트라사이클린 및 플루오로퀴놀론에 내성을 보인다.
  본 연구에서는 2007년에 국내 여러 지역에서 분리된 임균을 수집하여 항균제 감수성 양상, 내성 기전 및 분자유전학적인 연관성을 규명하였다. 총 68주의 임균을 수집하였으며, 일반 환자에서 43주, 특수 직업여성에서 25주를 수집하였다. 분리된 의료기관별로는 보건소를 포함한 1차 의료기관에서 59주, 2, 3차 의료기관이 9주였다. 페니실린 G에 감수성을 보인 균주는 없었으나, 중등도 내성을 나타낸 균주의 비율은 2006년의 23%에서 40%로 증가하였다.
  페니실린에 고도 내성을 보이는 PPNG의 분리 비율은 1992년도 70%에서 1998년도에는 84%까지 증가하였으나 이후 급속하게 감소하기 시작하여 2006년에는 11%, 2007년에는 15%로 감소하였다. 세프트리악손에 감수성이 저하된 균주는 없었으나 세픽심에 대한 MIC가 1μg/mL인 비감수성 균주가 하나 있었다. 세픽심에 대한 MIC가 ≥0.06μg/mL인 균주의 비율은 2003년의 40%에서 2007년에는 52%로 증가하였는데, 이는 높은 플루오로퀴놀론 내성율로 인해 세팔로스포린 계열의 항균제 사용량이 점차 증가하는 것에 의한 것으로 판단된다. 세픽심에 대한 MIC가 증가된 균주를 대상으로 시행한 penA 유전자 염기서열 분석에서 전형적인 모자이크형은 관찰할 수 없었으나, 일부 아미노산의 서열이 세팔로스포린에 대해 감수성을 가지는 임균과는 다르고, 비병원성 Neisseria 균종과 동일하여 점차 증가되는 세팔로스포린계 항균제 사용량을 고려하면, 앞으로 이에 대한 지속적인 감시가 필요할 것으로 생각된다. 또한 penA 유전자의 변이에 의한 PBP2의 모자이크형은 크게 6가지 유형으로 분류할 수 있었으나, 각 유형 안에서 역학적인 연관성은 없었고, 환자 군, 분리 지역 및 의료기관에 따른 연관성도 없었다. 테트라사이클린의 MIC50과 MIC90은 각각 2μg/mL과 32μg/mL으로 이전과 큰 차이가 없었으나, 감수성을 가진 균주가 3주(4%) 분리되는 된 것이 이전과 다른 특이한 양상이었다. 또한 TRNG의 분리률이 18%로 2006년의 7%에 비해 증가한 양상을 보였으나, TRNG 간의 역학적인 연관성은 없는 것으로 판단되었다. 시플로플록사신에 대한 감수성 균주의 비율은 2006년의 11%에서 2007년에는 25%로 증가하였는데 이는 플루오로퀴놀론의 사용 감소의 영향을 받은 것으로 생각된다. 그러나 아직도 의료기관에서 임균 감염 환자에게 플루오로퀴놀론을 처방하는 비율이 25%에 달하고, 새로운 유전자 변이가 QRDR에서 발견되는 것으로 보아 임균 감염증 치료에서 플루오로퀴놀론을 사용하는 것에 대한 검토가 필요하겠다. 2007년도에 수집한 임균은 25개 형 및 19개 아형으로 분류할 수 있었으며, 일부 균주에서는 2006년과 마찬가지로 환자와 특수 직업 여성에서 동일한 PFGE형을 나타냈다. PFGE형은 전반적으로 다양하였으나 일부 유형은 특징적인 양상을 보였다.
  결론적으로 국내에서 분리되는 임균 중에는 다약제 내성 균주가 흔하며, 특히 플루오로퀴놀론 내성 균주가 매우 흔하여 임균 감염증 치료에 있어서 항균제 감수성 시험없이 이 약제를 사용해서는 안되며, 항균력이 우수한 제3세대 세팔로스포린제에 대해서도 감수성 정도가 낮아지는 경향을 확인할 수 있었다. 따라서 이에 대한 지속적인 추적 및 감시가 필요하다고 하겠다. 

Ⅳ. 참고문헌
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