2007년 국내 홍역 유행주의 유전학적 특성 규명

Molecular epidemiology of measles viruses in Korea, 2007

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스팀   

Ⅰ. 들어가는 말
   홍역(measles)은 홍역 바이러스(measles virus)의 감염에 의해 일어나는 급성 열성 발진 질환으로 소아에서 주로 발생하며 후두기관지염, 중이염, 폐쇄 후두염, 폐렴 및 뇌수막염 등의 심각한 합병증을 동반할 뿐만 아니라 이로 인하여 사망이 초래되기도 한다. 홍역은 감염된 사람의 비말을 통한 호흡기 감염 또는 환자의 비, 인두 분비물과의 직접 접촉을 통해 전파되며, 발열, 기침, 결막염, 구강 내 Koplik 반점, 몸 전체에 걸친 구진상 발진 등의 임상소견을 나타내는 것이 특징이다. 잠복기는 8-12일이며 발진은 귀 뒤부터 시작하여 시간이 지남에 따라 얼굴, 몸통, 대퇴부 및 다리까지 퍼진다. 전염력이 매우 강해 감수성이 있는 접촉자의 90% 이상이 감염되고 불현성 감염은 거의 없는 것으로 알려져 있다[1, 2].
  홍역 백신은 1960년대 약독화 생 바이러스 백신이 개발되어 사용된 이후로 홍역의 유행이나 이환율 및 사망률이 현저히 줄어들었으나, 아직도 전 세계적으로 매년 300여만 명의 홍역환자가 발병하고 있고 약 90여만 명이 사망하는 것으로 추정하고 있다[3]. 우리나라의 경우 홍역 단독 예방백신의 접종은 1965년부터 실시되었으나 1970년대부터 1980년대 초까지도 매년 평균 4,000-6,000명의 환자 발생이 있다가 1985년 국가 예방접종이 실시되면서 보고된 환자수가 매년 1,000명 이하로 감소하였다. 이후 전 세계적으로 홍역의 대유행이 있었던 1989년과 1990년 2,000-4,000명으로 크게 증가되었으나, 이후로는 발생 수가 급격히 감소하여 1991년에는 257명, 1992년에는 38명의 환자만이 발생하였다. 그러나 1994년 들어 환자 수가 7,883명으로 폭발적으로 증가하였으며 이후로 홍역의 발생이 저하되었다가 2000년 대유행이 나타나 2001년 6월까지 전국적으로 약 54,000명 이상의 환자가 발생하였다[1]. 당시 유행의 원인을 홍역 감수성 연령대의 홍역에 대한 면역도 저하로 판단하고 2001년 홍역과 풍진백신을 감수성 연령 모두에게 접종하여 전국적인 홍역 면역도를 상승시킴으로써 대유행을 마무리할 수 있었다[1,2]. 이후 2005년까지 홍역 발생은 확진환자 10여명 정도의 매우 낮은 수준을 유지하다가 2006년 5월 인천지역 유치원에서 10여명 정도의 소규모 집단발생이 보고되었으나 WHO에서 제시한 홍역퇴치수준인 100만 명당 1명의 발생기준을 초과하지 않아 2006년 11월 우리나라는 홍역퇴치를 선언하였다. 그러나 2007년에 백신 미접종자를 중심으로 2, 3차 의료기관에서 병원감염과 관련된 184명의 확진환자와 13명의 의사환자가 발생하였다. WHO의 보고서에 따르면 우리나라의 주변 국가인 중국과 일본이 현재까지 홍역 유행지역에 포함되어 있으며, 중국의 대부분 지역에서는 H1 유전형, 일본은 D5 유전형이 유행주인 것으로 알려져 있다[4-6]. 이렇듯 우리나라와 인접한 주변국가가 유행지역이므로 홍역 환자로부터 바이러스를 분리하고 그 유전형을 분석하여 국내 홍역환자의 발생이 유행국가로부터의 유입인지 혹은 국내 토착발생인지를 명확히 파악하는 것은 국내 홍역퇴치수준유지에 있어 매우 중요한 사항이다.
  본 연구에서는 2007년 홍역 재유행에서 확인된 국내 유행주의 염기서열을 2000-2001년의 국내 유행주와 최근 보고된 중국, 일본 유행주의 유전형과 비교 분석함으로써 2007년 홍역 재유행의 원인을 분자유전학적 측면에서 해석하고자 하였다.

Ⅱ. 몸 말
  1. 재료 및 방법

  1) 대상
  2007년의 홍역의사환자로부터 채취되어 바이러스 분리를 위해 인플루엔자바이러스팀으로 송부된 호흡기 및 소변, 혈액 등의 검체를 대상으로 하였다. 홍역의사환자에 대한 임상적 진단은 세계보건기구의 기준에 따라, 38℃ 이상의 체온과 발진 및 3C 증상(기침, 콧물, 결막염)이 관찰되는 경우로 정의하였다[7]. 또한 홍역 환자에 대한 실험실적 진단은 혈청학적 검사, 바이러스 분리 또는 RT-PCR에서 양성인 경우로 이루어졌으며 이를 ‘확진환자’로 정의하였다.

   2) 혈청학적 진단
  홍역의사환자로부터 채혈한 혈액은 원심분리하여 혈청을 수집한 후 실험 전까지 -20℃에서 보관하였다. 홍역 항체검사는 Enzygnost Anti-Measles Virus IgM kit와 Enzygnost Anti-Measles IgG kit(Dade Behring, Marburg, Germany)을 이용하여 제조사에서 제시한 실험법에 따라 실시하였다. 홍역에 대한 IgM 항체검사 결과가 의양성인 경우에는 2주 후 2차 혈청을 채취하여 1차 혈청과 2차 혈청 내의 IgG 항체수치가 4배 이상 증가된 경우를 양성으로 판정하였다.

   3) 홍역 바이러스 분리
  홍역환자로부터 채취한 호흡기검체(인후도찰물, 비강도찰물 등)를 세포배양을 위한 접종용 검체로 사용하였다. 홍역 바이러스의 분리에는 WHO에서 분양받은 Vero-Slam 세포를 이용하였으며 세포는 5% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 유지하였다. 세포를 24 well cell culture plate에 계대배양한 후 세포 단일층(monolayer)이 형성되었을 때 배지 상층액을 제거하고 전처리된 각 검체를 200㎕씩 접종한 다음 35℃, 5% CO2 항온기에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 반응액을 제거하고 2% FBS가 첨가된 유지배지를 첨가하여 35℃, 5% CO2 항온기에서 배양하면서 세포병변효과(cytopathic effect)를 관찰하였다.

   4) 홍역 바이러스의 유전학적 진단(RT-PCR)
  홍역 바이러스의 RT-PCR 진단을 위해 환자로부터 채취한 검체 또는 바이러스 분리 세포배양액에서 Qiamp viral RNA 추출키트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 유전자 진단을 위한 RT-PCR은 추출된 RNA를 홍역 바이러스 nucleoprotein(N) 유전자에 대해 특이적으로 제작한 primer를 사용해 one-step RT-PCR을 수행하고, inner primer로 nested PCR를 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제하여 클로닝과정을 거쳐 염기서열을 분석하였다.

   5) 홍역 바이러스 유전자 염기서열분석
  염기서열 분석은 ABI Prism BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit ver. 3.1(Applied Biosystems, USA)와 ABI Prism 3730 Automatic Sequencer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 제작사의 방법에 따라 실시하였다. 분석된 염기서열은 DNA Star(Lasergene, USA)를 이용하여 계통분류학적 분석을 실시하였다.

   2. 결과

   1) 2007년 홍역의사환자 발생 현황
  2007년 홍역발생현황은 3주부터 홍역의사환자 신고가 이루어져 15주부터 홍역 확진환자가 보고되었고 20주째 가장 많은 의사환자가 신고되었다. 일반적인 홍역발생 시기인 15-25주에 집중적으로 홍역 확진환자가 발생되었으나 유행과 연관되어 35주까지 확진환자가 보고되어 발생지속기간이 일반적인 홍역 유행 시기보다는 길어진 것을 알 수 있었다(Figure 1, 2).

   2) 홍역 양성 환자 월별, 연령별 분석
  2004년부터 2007년까지 발생한 홍역 환자의 월별 분포를 살펴보면 Figure 2와 같다. 2006년의 소규모 유행은 봄철인 5월에 발생하였으나 2007년의 유행은 4월부터 시작하여 9월까지 지속되었다. 2007년의 홍역환자를 연령별로 분석한 결과 1세 미만이 58%, 1-5세가 28%로 전체적으로 0-5세가 86%를 차지하였다(Figure 3). 이는 2006년 전국 홍역 면역도조사사업의 결과와 같이 1세 미만 연령군의 홍역 면역 수준이 낮아 집중적으로 발병한 것으로 생각된다.

   3) 2007년 국내 유행 홍역 바이러스 유전형 확인
  2007년에 RT-PCR을 이용하여 홍역 특이 유전자가 검출된 65건 중 유전형 분석이 가능한 44건에 대하여 Nucleoprotein(N) 유전자를 분석한 결과 H1형 40건, A형 3건, D5형 1건이 확인되었다. 2007년 국내 유행주 간에는 유전적으로 99.6% 이상의 상동성이 관찰되었으며, 분자계통분류학적으로 분석한 결과 H1형 clade 내에서 2007년 국내 유행주만의 cluster를 형성하였다(Figure 4). 또한 2007년 국내 유행주는 2000-2001년 국내 유행주와 98.0%의 상동성을 나타내었으나 분자계통분류학적으로는 다른 cluster를 형성하였다. A형 3건은 홍역백신과 99.6%의 상동성이 확인되었고 홍역의사 증상 발현 전에 백신 접종력이 조사되어 백신과 연관된 것으로 추정하였다.

   4) 중국과 일본의 홍역 바이러스 유행주와 비교분석
  중국과 일본은 현재까지도 홍역이 유행하는 지역으로 매년 홍역 유행이 보고되고 있다. Zhang 등[8]과 Xuelian 등[9]의 연구에 따르면 중국은 1993년부터 2006년까지 대부분의 H1형이 지역에서 유행하는 것으로 보고하였고 1995년부터 2005년까지 중국에서 유행했던 홍역 바이러스 전체에 대하여 N 유전자를 분석한 결과 H1형을 cluster I, II로 구분할 수 있다고 보고하였다. 위 연구를 바탕으로 2007년 국내 유행주 및 2000-2001년 유행주를 비교한 결과 모두 H1의 cluster I에 속하는 것을 알 수 있었다. 하지만 2007년 국내 유행주의 경우 2000-2001년 국내 유행주보다 중국 유행주와 더 높은 상동성을 나타내었고 중국 유행주, 특히 2003년 Jiangxi, Shanghai 지역 분리주와 같은 cluster에 속하는 것을 알 수 있었다. 또한 홍역 바이러스의 외부 구조단백질로서 숙주와의 결합부위로 알려진 Haemagglutinin(H) 유전자를 분석한 결과도 N 유전자와 같이 2000-2001년 국내 유행주보다는 중국 유행주와 더 높은 상동성과 근연관계를 나타내었다(Figure 5).

  일본의 IASR(Infectious Agents Surveillance Report)에 따르면 2007년의 홍역환자는 전국적으로 482건이 보고되었고, 유전형이 분석된 341건 중 D5형이 326건, A형이 14건, H1이 1건으로 확인되었다. 또한 Yukio 등[10]의 보고에 따르면 2007년 일본 군마현에서 유행한 홍역의 유전형은 D5형이고 지난 10년간의 주요 유행주도 D5형이라고 보고하였다. 2007년 일본의 D5형과 2007년 국내에서 확인된 D5형은 99.6%의 상동성을 보였다. 2007년 국내에서 확인된 D5형 1건의 경우 역학적으로 일본인들의 왕래가 많은 병원의 환자에서 분리된 것으로, 다른 질환의 진료로 내원하였다가 후일 홍역 유사증상이 발생하여 신고된 사례로서 분자유전학적으로 2007년 일본에서 보고된 D5형과 99.6%의 상동성을 보였고 동일 cluster에 속하는 것으로 분석되어 일본 유행주의 국내 유입으로 추정하였다.

Ⅲ. 맺음말

   WHO에서는 홍역퇴치를 선언한 국가에게 가능한 홍역의사환자에 대한 실험실적 확진 결과를 확보하도록 강조하고 있다. 따라서 2006년에 이미 홍역퇴치를 선언한 우리나라에서는 홍역의사환자 발생 시 혈청검사를 통한 확진과 동시에 바이러스 분리를 통해 유전형을 확보함으로써 국내 유행주가 인근 유행지역으로부터의 유입인지 혹은 토착질환의 재발생인지를 신속히 판단하는 것이 홍역 유행방지 대책 수립에 매우 중요하다[3].
  2000-2001년 홍역 대유행 이후에 홍역백신의 대규모 접종과 홍역백신 접종확인서 제출 등의 노력으로 국내 홍역발생이 퇴치수준으로 유지되어 2006년 홍역퇴치를 선언한 바 있지만 이어 2007년에 홍역퇴치수준(인구 100만 명당 1명 확진환자 발생, 우리나라는 47명)을 초과하는 환자가 발생하여 이에 대한 여러 가능성이 제기되고 있다. 2007년 우리나라의 홍역 유행주로부터 확인된 유전자 분석 결과에 따르면 2007년의 국내 유행주 대부분은 2000-2001년�� 국내 유행주보다는 중국 유행주의 유전형과 더 높은 상동성과 근연관계가 확인되었다. 따라서 2000-2001년 우리나라에서 유행하였던 H1형의 토착화에 의한 재발생의 가능성보다는 2000-2001년 유행 잠식 이후 중국에서 유행하고 있는 바이러스가 국내로 유입되어 발생되었을 가능성이 더 클 것으로 추정된다. 특히 2007년에 확인된 D5형은 환자의 역학정보를 종합해 볼 때 일본으로부터 유입된 경우로 2007년도 우리나라에서 확인된 홍역 사례들은 환자의 발생이 지속적으로 보고되는 주변국가로부터 유입되어 유행한 것으로 짐작할 수 있다. 
  2007년 홍역 재유행 이후 지속적인 홍역퇴치수준 유지를 위하여 홍역 감시체계가 보다 활성화되어야 할 것이다. 그러기 위해서는 일선 의료기관에서는 홍역의사환자를 포함한 홍역환자 신고 및 실험실 확진을 위한 검체채취에 적극 협조하고, 질병관리본부는 채취된 검체에 대한 정확한 실험실 진단과 역학자료를 통하여 홍역의 국내발생 또는 해외유입 사례를 명확히 규명하여야 한다. 또한 국가 홍역퇴치유지위원회를 통해서 홍역의사환자의 적극적인 신고 및 검체채취를 독려하고 신속한 홍역확인체계를 구축함으로써 홍역을 조기 감지하고 전파를 차단할 수 있을 것이다. 
  궁극적으로 홍역퇴치수준을 유지하기 위해서는 홍역 유입 또는 유행 시 홍역 전파를 최소화하여야 하는데 이것은 홍역에 대한 높은 집단면역력을 유지함으로써 가능하다. 그러므로 높은 수준의 집단면역력을 유지하기 위해 적시 예방접종에 필요한 효과적인 교육과 홍보를 수행하여야 하며, 2000년 이후로 수행되고 있는 국가 홍역면역도 조사사업을 통하여 홍역에 대한 면역도를 지속적으로 모니터링해야만 한다. 또한 2007년의 홍역 유행시 환자의 주연령대가 백신을 접종하지 않았던 1세 미만이었으므로 백신 접종시기 변경 등 면역력 강화방안에 대한 논의가 필요할 것으로 생각된다[11]. 

Ⅳ. 참고문헌
 1. JK Lee, HW Cho, DK Oh. Elimination of measles-South Korea, 2001-2006. MMWR 2007;56:304 7.
 2. Na BK, Shin JM, Lee JY, Shin GC, Kim YY, Lee JS, Lee JK, Cho HW, Lee HJ, Rota PA, et al.: Genetic and antigenic characterization of
     measles viruses that circulated in Korea during the 2000-2001 epidemic. J Med Virol 2003, 70:649-654.
 3. WHO. Global measles and rubella laboratory network-update. Wkly Epidemiol Rec 2005a;80:377-88.
 4. Bellini WJ, Rota PA: Genetic diversity of wild-type measles viruses: implications for global measles elimination programs.Emerg Infect Dis
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 6. Rota PA, Liffick SL, Rota JS, Katz RS, Redd S, Papania M, Bellini WJ: Molecular epidemiology of measles viruses in the United States,
     19972001. Emerg Infect Dis 2002, 8:902-908.
 7. WHO Laboratory Manual for Laboratory Diagnosis of Measles and Rubella 2006 http://www.who.int/immunization_monitoring/
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 8. Zhang Y, Zhu Z, Rota PA, Jiang X, Hu J, Wang J, et al. Molecular epidemiology of measles viruses in China, 1995-2003. Virol J 2007;4:14.
 9. Xuelian Yu, Fangxin Qian, Yinzhong Sheng, Desheng Xie, Dan Li, Qin Huang, Yong Zhang, Zhenghong Yuan, Reena Ghildyal: Clinical and
     genetic characterization of measles viruses isolated from adult patients in Shanghai in 2006. J Clin Virol 2007, 40:146-151.
 10. Yukio M, Tomoyuki S, Masataka S, Masae S, Mika S, Hiroyki T, et al. Sequence and phylogenetic analysis of nucleoprotein (N) gene in
       measles viruses prevalent in Gunma, Japan, in 2007. Jpn J Infect Dis 2007, 60:402-404.
 11. 질병관리본부. 2006 홍역·유행성이하선염·B형간염 면역도조사 결과 보고서. 질병관리본부. 2007.