2009-2010 절기 인플루엔자 A(H1N1) 2009 바이러스의 항바이러스제 내성 분석
Antiviral drugs resistance of influenza A(H1N1) 2009 virus isolated in Korea during 2009-2010 season

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스과        
최장훈        
  

Ⅰ. 들어가는 말
  2009년 4월 미국 캘리포니아와 멕시코에서 인플루엔자 A(H1N1) 2009 바이러스가 확인된 이후 매우 빠른 속도로 전 세계적으로 전파됨에 따라, 2009년 6월 11일 세계보건기구(World Health Organization; WHO)는 ‘세계 대유행 주의 6단계’를 선언하였다. 인플루엔자 A(H1N1) 2009 인체감염에 대한 예방 및 대유행에 대비하여 전 세계적으로 항바이러스제 비축 및 사용량이 증가함에 따라 WHO를 중심으로 한 각국에서는 인플루엔자 치료제에 대한 내성 양상을 모니터링하고 있다.
  인플루엔자 A(H1N1) 2009에 대한 뉴라미니다아제(neuraminidase; NA) 억제제인 오셀타미비르 (Oseltamivir, 상품명 타미플루) 내성은 전 세계적으로 총 298건이 보고되었는데(WHO, 2010. 6. 16.), 지역적으로는 서태평양 지역에서 116건, 유럽지역에서 99건, 미주지역에서 82건, 동지중해 지역에서   1건이 발생하였다. 이들은 대부분이 면역저하자이거나(24%), 오셀타미비르를 투여받은 환자로부터 검출되었으며 (27%), 이외에 치료제 사용과 무관한 사람(9%)에서도 내성주가 발생한 것으로 확인되었다(Figure 1) [1]. 현재까지 오셀타미비르 내성주는 다른 치료제인 자나미비르(Zanamivir, 상품명 릴렌자)에는 감수성, M2 억제제인 아만타딘(Amanta-dine)에는 내성인 것으로 나타났고, 감수성 바이러스와  비교 시 NA 유전자의 275번째 아미노산이 히스티딘(Histidine; H)에서 타이로신(Tyrosine; Y)으로   치환되었으며, 성장특성이나 병원성은 차이가 없는 것으로 보고되어 있다.
  질병관리본부 인플루엔자바이러스과는 국내에서의 치료제 내성현황을 파악하기 위하여, 2009년 5월 초부터 ‘인플루엔자 및 호흡기바이러스 실험실감사업’ 등을 통하여 확보한 검체 및 바이러스를 대상으로 아만타딘, 오셀타미비르 및 자나미비르에 대한 내성 검사를 실시하였다. 또한, 2010년 10월 이후부터는 중증 및 치료제 투여 후에도 호전되지 않는 환자(바이러스가 지속적으로 검출되는 환자) 대상으로도  치료제 내성양상을 조사하였다.

Ⅱ. 몸 말
  항바이러스제 내성 분석을 위하여 2009-2010 절기 ‘인플루엔자 및 호흡기바이러스실험실감시사업’을 통해 확보된 검체 및 바이러스 526건, 2009년 4월부터 2010년 12월 15일 현재까지 실험실 확진 의뢰된 1,018건, 그리고 중증 및 치료제 무반응 환자로부터 의뢰된 67건을 포함한 총 1,611건에 대하여 M2 억제제인 아만타딘과 뉴라미니다아제 억제제인 오셀타미비르 및 자나미비르에 대한 내성 검사를 실시하였다.
  인플루엔자 항바이러스제 내성 분석은 주로 유전형 분석법(genotypic assay)을 이용하였으며, 일부 바이러스에 대해서는 표현형 분석법(phenotypic assay)을 적용하였다. M2 억제제 유전형 분석은 인플루엔자 바이러스의 M2 유전자에 대한 염기서열 분석을 통해 아만타딘 내성과 관련된 아미노산 변이(L26F, V27A, A30T, S31N, G34E) 부위를 확인하였다. 뉴라미니다아제 억제제에 대해서는 NA 유전자의 염기서열 분석을 통해 내성과 관련 있는 아미노산 부위(E119V, R152K, D199N, H275Y, R293K 및 N295S 등)에서의 변이 여부를 확인하였다. 각 유전자별 염기서열 분석을 위해서는 유전자 특이   프라이머(Table 1)를 사용하여 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 유전자를 확보하였으며 염기서열 분석은 ABI사의 3730 DNA analyzer를 이용하여 분석하였다.
  뉴라미니다아제 억제제에 대한 표현형 분석을 위해서 먼저 MDCK 세포주를 이용하여 바이러스를   분리한 후 세계보건기구 인플루엔자협력센터인 호주 인플루엔자 표준실험실(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)에서 제공하는 형광뉴라미니데이즈억제법(Fluorometric Neuraminidase Inhibition Assay, WHO-025)을 사용하여 NA억제제 IC50를 정하였다. 호주 인루엔자 표준실험실에서 제시한 감성주에 대한 IC50 농도는 50-200 nM이면 중등 내성이고, >200 nM일 경우에는 고도 내성으로 판정하였다.
  2009년 4월 24일부터 2010년 12월 15일까지 확보된 국내 인플루엔자 A(H1N1) 2009 바이러스   유전형 분석결과, 총 1,611건 모두 M2 억제제에 대해 내성을 보였다. NA억제제에 대해서는 2009-2010 절기 인플루엔자 감시체계를 통해 지역사회에서 확인된 바이러스(526건)와 진단 의뢰된 1,018건의 경우 모두 내성이 없는 것으로 나타났다. 반면, 중증 및 치료제 투약 후에도 증상이 호전되지 않는 환자(67건)에서는 총 11건(11/67, 16.4%)이 오셀타미비르에 대해 내성인 것으로 확인되었다(Table 2). 국내에서 첫 번째 오셀타미비르 내성사례는 2009년 11월 30일, 수도권 거주 5세 남자 인플루엔자 A(H1N1) 2009 환자로부터 처음 보고된 이후 오셀타미비르를 5일 이상 투여받은 중증환자   (천식, 당뇨 등의 만성질환자) 또는 치료제 투약과 관련된 환자군에서 10건이 추가로 확인되었다. 내성주가 검출된 환자의 연령별 분포는 5세 미만의 어린이가 54.5%(6건), 40세 이상의 성인이 36.4%(5건)이었으며, 내성 바이러스는 모두 NA 유전자에서의 H275Y 변이가 확인되었다[4](Table 3). 또 다른  인플루엔자 치료제인 자나미비르에 대해서는 임상증상 중증도와 상관없이 분석대상 바이러스 모두 감수성인 것으로 나타났다(0건/1,611건, 0%).
  총 11건의 내성주로부터 분리된 바이러스 2주를 이용하여 내성주 표현형 분석을 실시한 결과, IC50 값은 오셀타미비르에 대해 각각 713.2 nM, 359.4 nM이며, 자나미비르에 대해서는 0.13 nM 및 0.78 nM이었다. 오셀타미비르 내성바이러스는 모두 역학적인 연관관계가 없는 환자로부터 확인되었으며,   특히 일부 다중검체(동일 환자로부터 각기 다른 날 채취된 검체) 분석을 통하여 처음 감염 시에는 오셀타미비르 감수성이었으나, 항바이러스제 투여 중 감수성 바이러스가 내성바이러스로 전환되었음을 확인할 수 있었다. Figure 2의 (A)에서는 처음부터 내성주 유전형(TAC; Tyrosine)을 갖는 환자A와 H를 나타내고 있고, (B)와 (C)에서는 다중 검체를 분석한 환자 E와 G에서 감수성주(CAC; Histidine)가 내성주 유전형(TAC; Tyrosine)으로 전환되었음을 보여준다. 또한 내성주와 감수성주 유전형이 혼재된 것은  중복감염이 아닌 하나의 바이러스로부터 유래된 것을 HA 유전자의 상동성으로 확인할 수 있었다[4]. 이는 기존의 감수성 바이러스 감염 이후 재감염이 아닌 항바이러스제 투여 과정에서의 바이러스 변이가 발생된 것으로 추정된다.
                            

Ⅲ. 맺는 말

  뉴라미니다아제 억제제인 오셀타미비르와 자나미비르는 아만타딘에 비해 내성주 발생 비율이 낮고,  A형과 B형 인플루엔자바이러스 모두에 억제 효과를 나타내기 때문에 인플루엔자 치료 및 예방에 널리 사용되고 있다[2].
  그러나 2009년 대유행한 인플루엔자 A(H1N1) 2009 바이러스에서도 내성주가 확인됨에 따라, Global Influenza Surveillance Network(GISN)을 중심으로 치료제 내성주 감시사업이 더욱 강화되고 있다. 우리나라도 이러한 중요성을 인지하고 2009년 발생 초기부터 ‘인플루엔자 및 호흡기바이스감시 사업’ 등을 통하여 항바이러스제 내성 감시를 강화하고 있다[3].
  본 조사를 통하여 2009-2010 절기 동안 국내에서의 인플루엔자 A(H1N1) 2009 바이러스는 오셀타미비르에 대한 내성률은 0.68%로 나타났으며, 자나미비르에 대해서는 내성이 없음을 확인하였다. 내성바이러스주는 치료를 받은 환자에서 주로 나타났기에 인플루엔자 A(H1N1) 2009 바이러스에 대한 경험적인 항바이러스제로 오셀타미비르나 자나미비르 모두 효과가 기대된다. 하지만, 오셀타미비르 투약 후 증상이 호전되지 않는 환자에 대해서는 자나미비르가 치료에 효과적일 것으로 판단된다. 또한 본 조사에서는 표현형 분석 시 포함되지 않은 페라미비르(peramivir) 약제에 대해서도 추후 분석이 필요할 것으로 사료된다.
  결론적으로 국내에서 확인된 오셀타미비르 내성주는 현재까지 지역사회로 전파되어 유행하지 않는 것으로 분석되며, 항바이러스제 투여 과정에서 감수성에서 내성주로 변이된 것이 확인됨에 따라 현재   운영하고 있는 ‘인플루엔자 및 호흡기바이러스 실험실감시사업’ 및 중증환자 등 특수 집단을 대상으로 하는 감시를 통하여 지속적으로 모니터링하는 것이 필요할 것으로 판단된다. 더불어 국내 인플루엔자 바이러스 내성주 분석 자료는 현재 전 세계 인플루엔자 감시체계(GISN) 및 국내 의료인 등 관련자들에게 주기적으로 제공됨으로써 전 세계적인 인플루엔자 내성주 발생 양상과 효과적인 치료제 사용을 위한 기본 자료로 활용되고 있다.

Ⅳ. 참고문헌

1. World Health organization (WHO), 2010. Weekly update on oseltamivir resistance to pandemic influenza A (H1N1) 2009 viruses. 2010. 06. 16.
2. McKimm-Breschkin, J.L., 2000. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors-a review. Antiviral Res. 47, 1-17.
3. Choi W.Y., Kim S.J., Lee N.J., et al., 2009. Amantadine-resistant influenza A viruses isolated in South Korea from 2003 to 2009. Antiviral Res. 84, 199-202.
4. Hwajung Yi, Joo- Yeon Lee, Eun-Hye Hong, Mi-Seon Kim, Donghyok Kwon, Jang-Hoon Choi, Woo-Young Choi, Ki-Soon Kim, Jong-Koo Lee, Hee-Bok Oh, Chun Kang (2010). Oseltamivir-resistant infection of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus in South Korea. Emerg. Inf. Dis. 16(12) 1938-1942