I. 들어가는 말

  당뇨병은 비만과 함께 21세기 들어 지구촌에서 가장 급격히 증가하는 질환으로 2004년 Wild 등은 전 세계 당뇨병 환자가 2000년 당시 약 1억 7,100명에서 2030년에 약 3억 6,600만 명으로 늘어날 것이라고 추정한 바 있다[1]. 그러나 2013년 현재 전 세계 당뇨병 환자가 이미 3억 4,600만 명에 이르러 이러한 추세대로라면 2030년에는 그 예상치를 훨씬 넘어설 것으로 생각된다[2]. 우리나라에서도 지난 30년간 당뇨병 유병률은 1970년 1% 미만으로 추정되던 것이 1980년대 말에 약 3%로 증가하였으며, 2010년 기준 한국의 30세 이상 성인인구의 약 10.1%인 320만 명이 당뇨병 환자이고 당뇨병 전 단계에 해당하는 공복혈당장애에 해당하는 인구는 30세 이상 성인의 약 20%에 해당하는 620만 명에 달해 성인 10명 중 3명이 당뇨병 환자이거나 잠재적 당뇨병이라고 할 수 있다[3]. 국민건강보험공단에서 발표한 자료에 따르면 당뇨병 진료인원은 2006년 인구 10만 명당 3,305명에서 2010년 3,985명 연평균 4.8% 증가하였으며, 당뇨병으로 인한 총 진료비는 2006년 8,101억 원에서 2010년 1조 2,935억 원으로 연평균 12.4%가 증가하여 당뇨병 환자의 폭발적 증가와 함께 의료비 지출도 급격하게 증가하고 있어 국가적인 차원의 대책 마련이 시급한 현안으로 대두되고 있다.
  한편, 현재 우리나라 만성신장질환 유병률은 만30세 이상, 중등도 이상만 봤을 때 2009년 2.8%, 2010년 3.0%, 2011년 3.6%로 약 3% 수준으로 매년 증가하고 있고, 특히 65세 이상의 경우 유병률이 급격하게 증가하고 있다[4]. 건강보험심사평가원에서 발표한 자료에 따르면 만성신장질환 진료인원은 2010년 11만 7천명으로 2006년 8만 5천명 대비 약 4만 2천명(37.1%) 증가하였으며, 총 진료비는 2010년 1조 3,214억 원으로 2006년 8,953억 원 대비 약 4,251억 원(47.6%)이 증가한 것으로 나타났다. 여기서 중요한 사실은 이러한 신장질환 발병의 약 절반정도가 당뇨병으로 인해 발생한다는 것이다. 2010년 대한신장학회에서 발표한 자료에 따르면 신장질환 주요원인으로 당뇨병이 45.2%, 고혈압이 19.2% 그리고 만성사구체신염이 11.3%를 차지하고 이는 미국의 통계자료(당뇨병 43.8%, 고혈압 26.8%)와도 유사한 수치이다[5]. 따라서 만성신장질환의 발생예방과 치료를 위하여 무엇보다 당뇨병과의 관계에 대한 연구가 절실히 요구되지만 아직까지 당뇨병으로 인한 만성신장질환 발생조절에 대한 많은 연구가 진행되어 있지 않고 정확한 조절인자 규명과 질환의 제어를 위한 기반연구 또한 미흡한 실정이다.

  이 글에서는 대사체 분석법 및 당뇨병성 만성신장질환 모델의 소변 내 대사체를 분석하여 얻은 결과를 일부 소개하고 그 결과를 이용한 기능연구가 향후 당뇨병성 신장질환을 제어하는데 기여할 가능성에 대하여 전망해보고자 한다.


II. 몸 말

  당뇨병성 신장질환은 당뇨병으로 인해 초래되는 미세소관 이상질환으로 당뇨병 환자의 20-40%에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 이 당뇨병성 신장질환의 발생은 당뇨병 발생 후 짧게는 3-5년, 길게는 15-20년 후에 나타나는데, 그 진행속도는 유전적 특성 및 예후 등에 따라 다르게 나타난다. 질병관리본부 대사영양질환과에서는 이러한 당뇨병성 신장질환을 효율적으로 예방하고 관리할 수 있는 기술을 개발하기 위해 구축한 질환모델 동물을 이용하여 주요 유전자 변이, 단백체 변이 분석을 수행하였다. 아울러, 체내에서 대사과정이 이상조절 되어 생성되는 대사체들의 목록을 대사체 변이 분석을 통해 확보하였다. 우리는 이러한 결과를 활용하여 주요 대사경로의 이상조절을 규명하고 이를 조절할 수 있는 방법들을 찾는 기능연구에 활용하고자 한다.

  ‘대사체(Metabolome)'는 원래 세포 부유물(cell suspension) 혹은 모든 생체액(biological fluid) 안에 존재하는 분자량 100-1,000 사이의 작은 대사산물의 전체 집단을 말하는 것으로 DNA, RNA, 그리고 단백질은 제외하지만 이들이 분해되어 표적물질로 인지되는 경우를 포함한 몸속의 대사 작용에서 만들어지는 저분자량의 중간산물들을 말한다[6,7]. 대사산물들의 양은 유전적 요인은 물론 식생활과 같은 후천적 요인과 질병, 약물 등에 의해서도 변화되는데, 대사체학(Metabolomics)은 이러한 대사산물들의 분포를 분석함으로써 몸속의 생리작용이나 병리작용과 관련되어 있는 생화학적 대사경로나 그 변화를 예측하는 방법으로서 최근 유행하는 오믹스(omics)의 분야인 유전체학(Genomics), 전사체학(Tranomics), 단백체학(Proteomics)과 함께 인체 내 변화를 총체적으로 이해할 수 있는 학문이다. 유전체학과 전사체학, 단백체학은 분석에 많은 시간과 노력이 소요되고 유전체, 전사체, 단백체의 경우 각각의 표적 수가 약 22,000 (human), 100,000 이하, 1,000,000 개 이하인데 반해 대사체의 경우 이들보다 그 표적 수가 혈청(serum) 1,122개, 소변(urine) 458개, 체액(CSF, 뇌척수액) 309개로 훨씬 적어 분석이 상대적으로 쉽다는 장점이 있다[6]. 특히 대사체학은 유전적인 영향보다는 생활습관 및 노화 등 환경적 요인들에 의해 더 많이 영향을 받는 것으로 알려져 있고 유전체 정보가 미래에 다가올 위험인자를 포함하고 있다고 한다면 대사체 정보는 현재에 나타나는 위험인자를 포함한다는 점에서 그 차이가 있다. 따라서 완전한 대사체의 프로파일은 그 자체로 또는 유전자 발현과 연관된 데이터정보와 조합하여 표현형 결정에 대한 생리학적 기초정보를 제공할 수 있다(Table 1).

  대사체 분석 연구에 주로 사용되고 있는 방법은 핵자기공명장치(Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)와 질량분석법(Mass spectrometry, MS)이다. 대사체 분석 연구에 있어서 NMR 분석은 주로 1H와 13C NMR 분광(Spectroscopy)을 주로 이용하며, 고에너지인산기(high-energy phosphate) 대사체와 인산화된 지질 중간체 등을 분석하기 위해서는 31P NMR 분광을 사용하기도 한다. NMR의 장점은 기본적으로 샘플을 분해하지 않으며 분석방법이 재현성이 좋고 신뢰할만한 결과를 얻을 수 있고 샘플준비 과정에 분리나 이온화 등이 필요하지 않아 단순하다는 장점이 있으나 질량분석법에 비하여 감도가 낮다는 단점이 있다. 반면 질량분석법은 대사물질들을 탐지하고 정량할 수 있을 뿐만 아니라 분자구조까지 파악할 수 있는 매우 유용한 방법이다. 질량분석법은 기본적으로 샘플의 분해가 필요하고 준비과정에 많은 노력이 들어간다는 단점이 있음에도 NMR과 비교할 때 가장 큰 장점은 높은 민감도를 갖는 것이라 할 수 있다. 일반적으로 질량분석법은 대사체들의 혼합물을 분리하기 위하여 다른 분리방법과 조합하여 사용되는데 그 중에서 가장 널리 사용되고 있는 분석방법이 기체크로마토그래프/질량분석기(Gas chromatograph/MS)와 액체크로마토그래프/질량분석기(Liquid chromatograph/MS)방법이다. GC/MS 방법은 분석하고자 하는 샘플에서 대사체 추출 및 농축을 위한 적절한 전처리를 하여 소변 등 생체시료를 이용할 때에도 감도가 높고 재현성이 뛰어나며 경제성이 뛰어난 장점을 가지고 있다.
그러나 샘플을 정제하는 처리과정이 필요하므로 더 많은 시간이 소요되고 GC의 특징에 알맞지 않은 분석물질들은 분석하기 어렵다는 단점을 가지고 있다. GC/MS는 주로 휘발성 대사체를 분석하는데 사용되는 것으로 비휘발성 분석물질을 메톡실화 및 실릴화를 시켜 유도체화(derivatization)를 시켜야하는 전처리의 번거로움이 있으며 유도체화 된 기에 의해 원래 물질의 성질이나 특성의 변화가 발생될 가능성이 있는 단점이 있다[7,8]. LC/MS는 GC/MS와 감도가 유사하고 GC/MS에서 필요한 전처리과정이 필요하지 않기 때문에 널리 사용되고 있는 분석방법이다. 그러나 LC/MS는 상대적으로 고가의 장비이며 GC/MS에 비해 재현성이 떨어지는 단점과 분석하고자 하는 대사체들을 이온의 형태로 분석해야 하므로 양이온이나 음이온의 형태를 잘 형성하지 않으면 이온 형성을 위해서 추가적인 조건들을 설정해야 하는 어려움이 있다. 대신에 LC/MS는 컬럼의 선택, 이동상의 조합 등에 의하여 여러 가지 분리기술과 검출기술의 조합이 가능한 장점이 있다[6,7,9].

  앞의 두 분석법과 달리 최근에 사용이 늘고 있는 다른 방법 중 하나는 모세관전기영동/질량분석기 (Capillary electrophoresis/MS, CE/MS) 방법이다. 이 방법의 가장 큰 장점은 해상도가 매우 높다는 것과 다양한 생명체의 대사체 프로파일 분석이 용이하다는 것, 그리고 샘플에 존재하는 전기를 띤 저분자량의 모든 화합물을 실질적으로 동시에 정량화 할 수 있다는 것이다. 이러한 장점 때문에 CE/MS 방법이 세포, 조직 및 체액 내에 이루어지는 대사과정을 통합적으로 분석(high comprehensibility)하는데 최적의 방법이라 여겨지고 있다[10]. 특히 CE/MS 방법은 앞의 두 방법으로 얻을 수 없는 새로운 대사체 종류를 분석할 수 있어(Figure 1) 기존에 이미 보고된 당뇨병 관련 대사체 분석 결과 외에 추가적인 결과를 얻을 수 있고 우리 연구팀에서 관심을 갖고 있는 당분해 대사, TCA 대사, 아미노산 대사, 퓨린 대사 등과 관련된 대사과정을 통합적으로 분석 할 수 있어 당뇨병성 신증모델의 대사체 분석에 이 방법을 이용하였다(Table 2).

  연구는 이미 구축된 스트렙토조토신-유도 신장질환 모델(STZ-induced kidney failure model)과 정상군 쥐(n=3)의 소변을 채취하여 CE-TOFMS (Human Metabolome Tec, Inc., Japan) 방법을 이용하여 분석을 하였다. 그 결과 HMT 대사체 데이터베이스에 기반하여 총 243개의 대사체의 분석 결과를 얻을 수 있었다.
  먼저 당뇨병에 의한 합병증인 신장질환으로의 이환이 일어났는지를 확인하기 위해 소변 중 미세알부민, 크레아티닌, 질소의 양을 측정하였다. 각 실험 군에서 검출되는 생화학적 인자들을 분석한 결과 기존보고에서와 동일하게 스트렙토조토신을 처리한 후 2주와 8주 후에 각 실험군 쥐의 소변에서 크레아티닌 검출이 높게 나타났고, 이와 동일하게 알부민 단백질과 질소의 검출도 크게 증가됨을 보였는데 이는 스트렙토조토신을 주사한 쥐에서 신장기능이 떨어져 대부분의 단백질들이 신장에서 여과되지 않고 그대로 소변으로 배출됨을 보여주는 결과이다(Table 3).

  스트렙토조토신에 의한 신장손상을 확인하기위해 각 실험군의 신장조직을 기저막과 결체조직을 특이적으로 염색하는 과요오드산(Periodic acid- Schiff stain)을 이용해 사구체(Glomerulus) 기저막 비후여부와 메산지움(Mesangium) 기질의 확장 상태를 확인한 결과 Figure 2에서 보는 바와 같이 처리군에서 메산지움의 증식이 보였고 모세혈관의 손상이 관찰되었다. 또한 처리군에서 사구체 경화의 소견을 보였고 사구체의 손상정도가 크게 증가되어 있음을 확인하였다. 한편 족세포(Podocytes)의 인지지표로 알려진 WT-1의 발현이 크게 감소되는 것으로 보아 이는 사구체 전체의 손상이 야기되고 있음을 알 수 있었다.

  대사체 분석데이터를 주요구성성분분석(Principle component analysis, PCA)한 결과 Figure 3과 같이 정상군과 STZ 처리군에서 두 군이 서로 확연히 분리되었다. 여기서 PC1과 PC2는 첫 번째 주요 구성성분과 두 번째 구성성분을 나타내며 각각의 수는 기여율을 나타낸다. 정상군의 경우 개체군 간 차이가 크지 않게 군집형성이 잘되어 있는 반면 STZ의 경우 한 군에서 PC2의 범위 차이가 크게 나타나고 있었다. 이는 각 개체에서의 질환 발생 단계별에 따른 차이일 것으로 여겨진다.

  이들 분석 결과를 계층군집분석(Hierarchical cluster analysis, HCA)하여 보면 개체군간의 차이를 좀 더 쉽게 관찰 할 수가 있다. Figure 4에서 가로축과 세로축은 각각의 샘플 이름과 대사체들의 정량 결과를 보여준다. 그림에서 보는바와 같이 전체적으로 대사체의 양이 정상군과 STZ군의 차이가 확실하게 대비되어 나타나는 것을 볼 수가 있었다. 특히 1번과 2번 간의 대사체 양의 차이는 크게 감소를 함을 보였고 4번 5번에서는 정상군에 비해 크게 증가함을 보였다.

  분석된 총 248개의 대사체들 중 STZ군에서 3배 이상 증가한 대사체는 24개였다. Table 4에서 보는바와 같이 크레아틴(urine creatine)의 양이 약 26배 까지 증가되어 있었고 트란스-글루타코닉산(trans-glutaconic acid)은 24배, 젖산(Latic acid) 11배, 니코틴산(Nicotinic acid) 6.3 배, 피루브산(pyruvic acid) 4.7 배로 증가됨을 확인하였다. 이외에도 2배 이상 증가한 대사체 30개, 1.5배 이상 증가한 대사체는 35개였다. 반대로 감소한 대사체들도 39개를 확인하였다(본 원고에서는 결과 제시하지 않음).

  이렇게 군 간에 특이적으로 변화하는 대사체들을 근거로 하여 각 질병 발생과의 상관성 연구 및 질병의 발생을 예측하여 기능연구를 수행하는데 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 일례로 STZ군에서 크게 증가한 트란스-글루타코닉산은 글루타르산증 1형(Glutaric acidemia type 1)이라는 상염색체 열성 유전질환의 주요 표지물질로 알려져 있다. GA1은 글루타릴 코에이 탈수소효소(GCDH)의 결핍으로 인하여 체내에서 라이신, 하이드록시 라이신 그리고 트립토판을 완전히 분해하지 못하여 그 중간대사산물이 축적되어 생기는 질환인데 그 중 하나가 트란스-글루타코닉산이다[11]. 
  글루타르산증 1형과 당뇨병과의 관련성을 보고한 연구결과는 아직 없어서 당뇨병에서 왜 아미노산 대사과정의 이상이 발생하는지 또 이것은 신장기능에 어떠한 영향을 미치는지를 규명하는 것이 연구팀에서 연구해야할 흥미로운 주제 중 하나이다. 우리 연구팀에서 대사체 분석 결과를 놓고 관심을 갖고 있는 또 다른 대사과정은 호기성 해당과정(aerobic glycolysis)이다. 호기성 해당과정은 와버그 효과(Warburg effect)라고도 하는데 주로 암세포가 산소가 충분한 조건에서도 미토콘드리아 호흡 대신 해당과정을 통해 에너지를 생산하고 단백질, 지방 등을 활발하게 합성하는 과정을 일컫는다[12]. 이 과정에서 세포 내 포도당 섭취가 늘고 피루브산이 증가하게 되는데 이렇게 증가된 피루브산이 대부분 젖산으로 전환되게 된다. 따라서 젖산 생성 경로를 억제 또는 차단하여 미토콘드리아 호흡을 증가시키게 되면 암세포의 성장과 활성을 억제 할 수 있는 것으로 알려졌으며 이를 이용한 항암제 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 최근 들어 암세포 외의 면역세포 등에서 호기성 해당과정이 세포의 특성변화에 관여함이 일부 보고되었을 뿐 대사이상질환 발생과의 관련성은 아직까지 거의 알려진 바가 없으며 호기성 해당과정을 억제하여 암 외에 다른 질병을 치료하고자 시도한 연구도 거의 없다. 특히 이 연구에서 확인한 당뇨병성 신증 모델에서 젖산 증가에 따른 대사이상 보고는 아직까지 없다.
  연구팀은 STZ를 처리한 쥐의 신장손상발생 여부와 호기성 해당과정 경로와의 관계를 확인하기 위해 우선 신장 조직에서 젖산 생성을 증가시키는 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase A, LDHA)의 발현을 조사하였다. 그 결과 LDHA의 발현이 사구체와 세뇨관(tubule)에서 크게 증가되어 있고 신장 섬유화의 주요인자인 TGF-β1의 증가와 함께 하위 신호전달자인 SMAD1, 2, 4의 발현도 함께 증가되어 있음을 관찰하였다
(Figure 5).

  또한 위 결과를 바탕으로 당뇨병성 신장질환 모델에서 크게 증가하는 젖산생성의 신호 경로가 신장 섬유화에 미치는 효과를 in vitro에서 조사하기 위해 두 종류의 신장세포주(Renal tubular epithelial cell, Mesangial cell)에서 젖산 생성 주요 효소인 LDHA와 PDK1의 활성 억제제를 각각 첨가하고 TGF-β1을 처리하여 보았다. 그 결과 두 세포주에서 TGF-β1에 의해 증가하는 섬유화 관련 유전자들의 발현 및 표현형들이 억제됨을 확인하였다. 연구팀은 상기 연구결과와 추가적인 기능연구들을 통하여 당뇨병성 신장질환 발생에 있어서 새로운 신호전달 경로 및 대사기능을 밝힘으로써 이들의 상호 조절 및 제어를 통하여 당뇨병성 신장질환 발생을 제어하고 치료할 수 있는 기술을 개발할 수 있을 것으로 기대하고 있다.


III. 맺음말

  당뇨병이 폭발적으로 증가하고 있고 신장질환 발생의 상당수가 당뇨병에 기인하는 상황에서 당뇨와 신장질환 발생의 상관관계에 대한 연구는 당뇨병은 물론 신장질환도 함께 예방, 관리 치료하는데 반드시 필요한 분야라고 생각된다. 이는 기초연구를 포함한 중재, 임상연구가 유기적으로 이루어질 때 그 효과가 극대화 될 것이다. 이러한 의미에서 우리 연구팀은 당뇨병성 신장질환 모델을 구축하고 이를 근거로 질환의 주요 조절인자 및 대사인자들을 발굴 하였으며 이렇게 발굴된 인자들로 후속 기능연구를 수행하고 그 결과가 질환 발생 제어와 치료를 위한 중재, 임상연구에 필요한 기초 자료로 활용될 수 있도록 노력하고 있다. 앞서 제시한 연구결과에서 각 질환 발생에 있어서 기존에 이미 보고된 대사체들도 다수 포함되어 있을 것으로 여겨진다. 그러나 실제 이 연구에서 구축한 모델에서의 재현되는 결과를 간과해서는 안 될 것이다. 뿐만 아니라, 수십 배에서 수백 배의 변화를 갖는 대사체 중에 지금까지 관련 보고가 한건도 되어 있지 않은 경우도 있었다. 이러한 여러 대상군들을 선별하는 작업이 매우 중요하고 이를 실험을 통하여 직접 확인하여 새로운 이론을 만들어 가는 것이 앞으로 우리에게 주어진 과제라 할 수 있다. 현재 발굴된 몇 가지 대사체 변화를 바탕으로 대사신호경로와 질병 발생간의 상관성 추적과 함께 기능연구를 수행하고 있어 조만간 이들에 대한 정확한 역할과 기능에 대한 결과들을 얻을 수 있을 것이다.


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