Ⅰ. 들어가는 말

  고위험병원체란 「감염병의 예방 및 관리에 관한 법률」에 의하여 생물테러의 목적으로 이용되거나 사고 등에 의하여 외부에 유출될 경우 국민 건강에 심각한 위험을 초래할 수 있는 감염병병원체로 정의되며 보건복지부령에 의하여 지정된 14종의 세균 및 진균, 21종의 바이러스 및 프리온이 이에 해당한다. 고위험병원체는 그 특성상 소량으로 짧은 시간에 다수의 인명 피해를 초래할 수 있으므로 생물테러 의심상황 또는 기타 유출 사고 발생 시 이를 탐지하고 의심환자의 검체로부터 정확한 원인 병원균을 신속히 확인하여 대처할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 따라서 신속하고 정확한 고위험병원체 탐지를 위한 기술 개발 분야는 가장 중요한 고위험병원체 연구 분야의 하나라고 할 수 있다.

  기존의 고위험병원체 탐지 방법으로 1) 고위험병원체 특이 배지를 사용하여 배양하는 방법, 2) 항체를 사용하여 고위험병원체 특이 항원을 인식하는 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 그리고 3) 고위험병원체 특이 핵산을 증폭하여 확인하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)의 3가지 방법이 주로 사용되고 있다. 배양으로 고위험병원체를 탐지하는 방법은 병원체에 따라 3일에서 1주일 이상의 배양 시간이 필요하기 때문에 시간이 오래 걸리며 ELISA 및 PCR은 1일 이내로 병원체 반별이 가능하지만 적은 검체에서 다양한 병원체를 고감도로 검출하는 데에는 기술적인 한계를 보이고 있다. 따라서 고위험병원체를 탐지하고 감염여부를 진단하기 위한 필수 요건인 신속성, 정확성 및 다중 탐지 능력을 가지는 새로운 기술의 개발이 요구되고 있다.

  최근 나노 기술 및 나노 물질에 대한 연구가 활발해 지면서 나노 입자를 기반으로 유전자 및 단백질 등의 검출 감도를 높이는 방법에 대한 연구가 증가하고 있다. 다양한 나노 기술들을 이용한 탐지 기법들이 종양 특이 마커를 검출하는 방법으로 검증되고 있으며 기존 기술의 한계를 극복할 수 있는 방법 및 가능성을 제시하고 있다. 최근에는 감염병 관련 연구에서도 나노 기술을 바탕으로 한 새로운 병원체 탐지 기법 개발이 시도되고 있으며 이런 연구들이 특히 고위험병원체의 신속 정밀 다중 탐지에 필요한 기술들을 제공할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
이 글에서 나노 기술에 바탕을 둔 병원체 탐지 기술 연구의 간략한 소개와 현재 질병관리본부 국립보건연구원에서 진행 중인 나노입자기반 고위험병원체 탐지 기술에 대하여 소개하고자 한다.


Ⅱ. 몸 말

  나노 기술을 바탕으로 병원체 탐지를 위한 바이오센서 제작에 있어서 가장 많이 사용되는 나노물질은 금 나노입자(gold nanoparticle) 이다. gold nanoparticle은 항체, 펩타이드 및 핵산과 같은 물질과 쉽게 결합시킬 수 있으므로 이를 통하여 병원체 또는 그 부산물을 감지할 수 있는 특이성을 부여하는 것이 용이하다. 또한 gold nanoparticle의 특징적인 광학적, 전기화학적 특성을 이용하여, 병원체에 결합한 gold nanoparticle의 존재를 확인함으로써 병원체를 탐지하는 ‘바이오센서’로서 작용하도록 하게 된다. Gold nanoparticle 또는 금 박막(gold layer)의 광학적 성질을 이용한 대표적인 병원체탐지 기술은 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance: SPR)과 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy: SERS)이다. SPR은 금속 박막 표면에 물질이 결합된 경우 조사된 빛의 굴절률이 변화로 인한 공명각을 측정하여 결합된 물질의 농도를 측정하는 방법이며 금속 박막에 병원체 특이 항체를 결합시켜 탐지 대상 병원체 특이성을 부여하도록 제작 한다(Figure 1). 앙카라중동전문대학(Hacettepe university) 연구팀에서 SPR을 이용하여 3cfu/mL의 대장균(Escherichia coli)을 검출해 내는데 성공하였고, 대만국립대학 연구팀에서는 SPR과 등온 증폭법(loop-mediated isothermal amplification)을 응용하여 2fg/mL의 B형 간염 바이러스(human hepatitis B virus) 유전자를 검출하는데 성공하였다[1,2].

  라만 분광법은 단색광의 조사에 의하여 진동운동을 하고 있는 분자로부터 에너지를 흡수, 방출, 또는 아무 변화 없이 통과시킬 때 발생하는 산란 파장을 측정하는 것이다. 이때 발생하는 라만 산란(Raman scattering)을 gold layer 또는 gold nanoparticle에서 발생시키면 금속과 조사 레이서의 공명현상에 의하여 라만 산란 신호가 최대 1011 배 증폭하게 되는데 이러한 기술을 SERS라고 한다. SERS를 이용하여 병원체를 탐지할 때에는 병원체 특이 항체가 결합된 gold layer또는 gold nanoparticle을 사용한다(Figure 2).

  서강대학교 연구팀에서는 SERS를 이용하여 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus: HIV)의 핵산을 200fg/mL 까지 검출하는데 성공하였고, 대만 National Applied Research Laboratories 연구진은 SERS를 응용하여 5분 이내에 황색포도상구균(Staphylococcus aures), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균을 5×103 CFU/mL 수준까지 탐지하는데 성공하였다[3,4].
바이러스는 전기가 통하지 않기 때문에 바이러스와 항체의 결합에 의한 전기 신호 감소를 측정하는 방법이 대표적인 전기/화학적 병원체 탐지기법이다. 다른 방법으로는 대상 병원체에 존재하는 특이적인 산화-환원반응을 이용하는 것이 있다. HIV의 경우 표면 단백질인 gp120이 산화에 의하여 결합이 끊어지게 되는데 이를 이용하여 항체에 결합된 HIV의 양을 indium Tin Oxide로 코팅된 유리위의 gold nanoparticle을 산화제로 사용하여 전기적 신호를 측정하는 방식으로 600fg/mL의 HIV의 바이러스 유사 입자(virus like particle)를 탐지한 보고가 있다(Figure 3) [5].

  Gold nanoparticle과 더불어 나노센싱 기술에 많이 응용되고 있는 물질이 자성체 나노 입자(magnetic nanoparticle) 이다. 수소원자는 세차운동(precession)을 하는데 세차운동의 회전축이 외부 자기장의 영향으로 기울어졌다가(spin-lattice relaxation: 횡자화) 다시 외부 전자기파를 끊어 주었을 때 주변의 변수들(spin-spin interaction, spin-lattice interaction)에 의하여 주변으로 에너지를 방출하면서 세차운동의 축이 다시 제자리로 돌아간다(spin-spin relaxation: 종자화). 종자화가 진행되면서 수소원자 세차운동 축의 횡자화가 37%까지 줄어드는데 걸리는 시간을 T2 이완시간이라고 하며 외부 전자기파가 클수록 T2 이완시간이 길어진다. 즉, 용액내의 자성체 나노입자가 많으면 T2가 길어지는 원리를 응용하여 병원체와 결합하도록 제조된 자성체 나노입자를 사용하여 병원체의 양을 측정할 수 있다. 자성체 나노입자를 사용하여 T2 이완시간을 측정하는 방법을 사용할 때 측정 대상이 자성체 나노입자의 크기 이하인 경우(바이러스, 단백질, 및 핵산 등)에는 측정 대상의 양에 비례하여 T2 이완 시간이 길어지지만 박테리아와 같이 나노입자보다 크기가 큰 경우의 많은 양이 있는 시료에서는 박테리아가 없는 샘플에서와 같이 자성체 나노입자가 흩어져 있는 상태가 되어 전자기파 생성이 낮아져 적은양의 박테리아가 있는 샘플보다 짧은 T2 이완시간이 측정되는 특이성을 나타낸다(Figure 4). 항체가 결합된 덱스트란(dextran)이 덮여있는 산화철 나노입자를 사용하여 10uL의 샘플에서 5 viral particle의 단순포진바이러스(Herpes Simplex virus) 및 아데노바이러스(adenovirus)를 탐지한 보고가 있으며, 구형(spherical) 산화철 나노입자를 사용하여 39CFU까지의 결핵균(Mycobacterium avium spp. paratuberculosis)을 검출하는데 성공한 사례가 있다[6,7]. T2 Biosystems 연구팀은 3시간 이내에 혈액 내의 Candida spp.를 1 CFU/mL 수준까지 검출하는데 성공했다[8].

  질병관리본부 국립보건연구원에서 고위험병원체 탐지 기법으로 응용하고 있는 나노 센싱기법은 ELISA기반으로 검출 신호 발생 방법을 효소반응 대신 gold nanoparticle을 사용하여 형광신호를 증폭하도록 설계된 ‘금 나노 입자에 의해 신호가 증가된 올리고 핵산이 결합된 면역 분석법(gold nanoparticle-signal enhanced oligonucleotide-linked immunosorbent assay (GNP-OLISA))’ 이다(Figure 5). OLISA에 사용되는 gold nanoparticle은 박테리아 항원 특이 항체 및 DNA probe가 연결되도록 제조된다. 제조한 gold nanoparticle이 박테리아 특이 항원과 결합한 이후 반응용액 내의 dithiothreitol (DTT)에 의하여 DNA probe가 gold nanoparticle로부터 떨어지게 되고 양 끝단에 형광체(fluorophore) 와 소광체(quencher)가 붙어있는 RNA probe와 결합한다. 이후 RNase H에 의하여 결합된 RNA probe가 분해되어 형광체가 소광체로부터 떨어져 나가면서 흥분 파장 광원(excitation light source)에 의하여 나타나는 형광 신호를 측정하여 해당 항원 및 박테리아의 존재와 양을 측정하는 탐지 기법이다.
  GNP-OLISA를 야토균(Francisella tularensis: F. t.) 모델에서 적용하기 위하여 야토균 특이 항원으로 알려져 있는 lipopolysaccharide (LPS) 에 결합하는 FB11 항체를 gold nanoparticle에 결합하여 제조하였다. 제조한 FB11-GNP-DNA probe를 야토균 와 같이 배양 후 투과전자현미경(transmission electron microscope: TEM)으로 분석한 결과 야토균 표면의 LPS에 제조한 FB11-GNP-DNA probe 가 특이적인 결합을 하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 6).

다음으로 야토균 LPS를 탐지 대상으로 하여 GNP-OLISA와 ELISA를 실시하고 검출 한계값(limit of detection: LOD)을 계산하였다(Table 1). 그 결과 ELISA를 이용한 경우 72.47±10.61 ng/mL까지의 야토균 LPS를 검출할 수 있는 것으로 나왔으나 GNP-OLISA로는 0.046±0.005 ng/mL의 야토균 LPS 까지 검출할 수 있는 것으로 계산되었다. 이 결과는 야토균 LPS에 대한 GNP-OLISA의 검출 민감도가 ELISA 보다 약 1,500배 이상 높다는 것을 의미한다.

  Abbreviations: ELISAenzyme-linked immunosorbent assay, GNP-OLISA=gold nanoparticle-signal enhanced oligonucleotide-linked immunosorbent assay, LPS=lipopolysaccharide, LOD=limit of detection
이후 야토균을 탐지대상으로 하여 GNP-OLISA를 실시한 결과 LOD 값이 23.47±0.36 CFU/mL로 나왔으며 ELISA의 LOD 값인 493.75±60.35 CFU/mL과 비교해 볼 때 그 검출 민감도가 21배 이상 높다는 것을 확인하였다(Table 2).

  또한 토끼 혈청에 야토균을 희석한 실험군 및 토끼 혈청과 탄저균 (Bacillus anthracis: B. anthracis)에 야토균을 희석한 실험군에서 측정한 GNP-OLISA의 LOD 값이 각각 29.63±4.54 CFU/mL 및 30.70±4.34 CFU/mL 로 계산되어 생체시료 및 기타 고위험병원체와 혼합되어 있는 야토균 또한 GNP-OLISA를 이용하여 특이적이고 민감도 높게 검출할 수 있었다.
이상의 연구결과를 통하여 GNP-OLISA를 사용한 고위험병원체 탐지기법이 기존 탐지기법을 대체할 수 있는 매우 높은 검출 민감도를 가지며 환경 및 임상 검체로 부터 관련 병원체를 확인하는데 사용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 또한 나노센싱 기법의 도입으로 기존 탐지 방법의 기술적 검출 민감성 한계를 극복할 수 있는 가능성을 제시하고 있다(Table 3). 


 Ⅲ. 맺는 말

  가장 이상적인 고위험병원체 탐지기법은 신속하면서 민감도가 높고 소량의 검체로 부터 다수의 병원체를 동시에 판별할 수 있는 것이다. 또한 측정기기의 휴대성이 추가되면 가장 완벽한 탐지법이라고 할 수 있다. 현재 나노 기술을 바탕으로 한 병원체 탐지 연구 결과들은 기존 병원체 검출법의 민감도 한계를 개선하면서 단시간 내에 병원체를 탐지해 낼 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 하지만 대부분의 나노센싱 기법들이 장비의 크기 및 사용가능 검출신호의 한계로 인하여 휴대성과 탐지의 다중성을 만족시키기에는 미흡한 점이 많다. 따라서 이후 나노센싱 기법들의 연구 목표에 있어서 검출 민감도 및 신속 탐지와 더불어 다중 탐지 및 현장성(또는 휴대성) 증대와 관련된 방향으로 진행되어야 할 것이다. GNP-OLISA는 고위험병원체 탐지기법에서 요구하는 많은 요소를 충족하고 있기 때문에 다양한 고위험병원체 및 독소 탐지용으로의 최적화 연구를 통하여 그 가능성을 현실화하는 연구를 진행 중에 있다. GNP-OLISA 뿐만 아니라 다양한 나노센싱 기술 기반 탐지 기술들을 고위험병원체 탐지에 응용하는 연구가 추진된다면 현재 국립보건연구원에서 운용중인 생물테러가능 병원체 및 독소 탐지 시스템을 보다 정밀하고 신속하게 대상 인자를 검출할 수 있도록 개선된 시스템이 갖추게 될 것이고 보다 효과적으로 생물테러를 대비할 수 있는 시스템이 빠른 시간 내에 갖추어 질 것으로 기대한다.


IV. 참고문헌

1. Torun O, Hakkı Boyacı I, Temür E, Tamer U. Comparison of sensing strategies in SPR biosensor for rapid and sensitive enumeration of bacteria. Biosens Bioelectron 2012 ;37:53-60.
2. Chuang TL, Wei SC, Lee SY, Lin CW. A polycarbonate based surface plasmon resonance sensing cartridge for high sensitivity HBV loop-mediated isothermal amplification. Biosens Bioelectron 2012;32:89-95.
3. Lee JH, Kim BC, Oh BK, Choi JW. Highly sensitive localized surface plasmon immunosensor for label-free detection of HIV-1. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 2013;9:1018-26.
4. I-Fang Chen, Chang HC, Chen TY, Hy C, Yang FL. Rapid identification of pathogen in human blood by electrokinetic concentration and surface-enhanced raman spectroscopy. Scientific reports 2013;3:2365.
5. Lee JH, Oh BK, Choi JW. Electrochemical sensor based on direct electron transfer of HIV-1 virus at Au nanoparticle modified ITO electrode. Biosens Bioelectron 2013;49:531-5.
6. Rossier JS, Perruche B, Morier P, Vollet C, Heini D, Michel P, Reymond F. Microfluidic based immunoassay, NanoBiotechnology. 2005;1:311–312.
7. Griffin J, Singh AK, Senapati D, Lee E, Gaylor K, Jones-Boone J, Ray PC. Sequence-specific HCV RNA quantification using the size-dependent nonlinear optical properties of gold nanoparticles. Small. 2009;5:839–845.
8. Lori A. Neely1, Mark Audeh1, Nu Ai Phung1, Michael Min1, Adam Suchocki1, Daniella Plourde1, Matthew Blanco1, Vasiliki Demas1, Lynell R. Skewis1, Theodora Anagnostou2, Jeffrey J. Coleman2,3, Parris Wellman1, Eleftherios Mylonakis2,3 and Thomas J. Lowery. T2 Magnetic Resonance Enables Nanoparticle-Mediated Rapid Detection of Candidemia in Whole Blood. Science Translstional Medicine. 2013;5:182ra54.