I. 들어가는 말

  일반적으로 human adenovirus (HAdV)는 사람의 호흡기 계통에 감염하여 질병을 일으킬 뿐만 아니라 결막염 및 장염 등 다양한 임상증상을 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. HAdV의 유전자는 이중 가닥의 DNA로 이루어져 있으며 현재까지 총 57 가지의 혈청형(serotype)이 알려져 있으며, 적혈구응집반응 저해시험(hemagglutination inhibition)과 생화학적 기준에 따라 A부터 G까지 7가지의 species로 나뉜다. 특히, B species 경우 virus entry에 관여하는 cellular receptor 차이에 따라 다시 B1과 B2의 subspecies로 나눠지기도 한다. HAdV species 중 B, C, E가 사람에게서 호흡기 질병을 유발한다고 보고되어 있다[1]. HAdV의 혈청형은 원래 면역화학적 또는 혈청학적 방법을 통하여 구분하였으나 최근에는 유전학적 또는 생물정보학적 분석법으로 대체되고 있다. 특히, HAdV의 penton, hexon, fiber의 type 특이적 단백질 구조에 의해 type 특이적 중화항체 반응 또는 적혈구응집반응이 나타나므로 이 단백질들의 구조를 결정하는 유전자 염기서열의 특징 분석을 통해 HAdV의 혈청형을 결정하고 있다. 같은 species에 속하는 type들은 유전자 수준에서 매우 유사한 것으로 알려져 있으나, 유전자 재조합이 흔하게 발생을 하며 대부분 같은 species 내에서 더욱 잘 일어난다고 보고되어 있다[2]. 2004년 포르투갈에서 재조합 HAdV 감염에 의한 급성호흡기 질환이 발생된 경우가 있으며, 특히 이런 재조합 HAdV의 경우 prototype에 비해 중증의 증상을 유발할 수도 있다고 분석된 바 있다[3]. 이뿐 아니라 최근 전 세계적으로 다양한 HAdV의 유전자 재조합주의 출현이 빈번히 보고되고 있는 실정이며(Table 1), 모두 HAdV 입자를 이루는 구조 단백질이다.

  질병관리본부 국립보건연구원 호흡기바이러스과에서는 2009년부터 운영하고 있는 급성호흡기감염증 감시 사업(KINRESS, Korea Influenza and Respiratory Viruses Surveillance system)을 통해 2010년 국내에서 HAdV에 의해 큰 유행이 발생한 것을 확인한 바 있다[4]. 이 유행기간 동안 분리된 HAdV의 주요 유전자 분석을 통하여 지금까지 보고되지 않았던 새로운 유전자 구성을 가진 재조합 HAdV를 확인하였기에 이 연구에서는 재조합 HAdV의 전장 유전자 특성 분석 및 새로운 형태의 재조합 바이러스의 출현에 따른 공중보건학적 의의를 고찰하고자 한다.


II. 몸말

  2010년 HAdV 양성 1,007건에 대해 hexon과 fiber유전자 염기서열을 분석한 결과, 2010년 8월 발열, 기침, 두통을 동반한 급성호흡기감염증을 나타내는 10세 남자환자에게서 채취한 검체로부터 hexon과 fiber의 type이 상이한 HAdV이 확인되었다. 이후 검체를 사람 폐세포주인 A549세포에 접종하였으며, 이로부터 재조합 HAdV를 분리를 하였고 분리된 HAdV로부터 전장 유전자를 확보하여 이를 대상으로 유전적 특성을 분석하였다.
A549 cell을 이용하여 분리된 재조합 HAdV는 plaque 정제를 3차례 실시하여 여러 가지형의 HAdV가 동시 감염되어있을 가능성을 배제하였다. 최종적으로 분리/정제된 HAdV를 A549 cell을 이용하여 대량 배양한 후 바이러스 상층액만 모아 사용 전까지 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 바이러스 배양 상층액으로부터 QIAamp viral RNA mini kit를 이용하여 핵산을 추출하였으며 HAdV B species 특이primer(총 98개)를 제작하여 전장 유전자 염기서열을 확보하였다. 확보된 유전자 정보는 MEGA4 프로그램을 통하여 연관성을 분석하였고 계통도(phylogenetic tree)를 구성하였다. 또한 Simplot 프로그램을 통하여 분리된 HAdV 유전자의 재조합 발생 여부를 확인하였다[5].
A549 cell에 접종한 HAdV는 접종 2-3일째에 HAdV에 의한 전형적인 세포병변 효과(CPE, Cytopathic Effect)를 나타내었다. 추출된 viral DNA를 이용한 partial-PCR을 통하여 총 34,780 nt의 전장 유전자를 확보하였으며 기본적인 유전자 특성을 분석한 결과 G+C content는 49%로 다른 HAdV B species에 속하는 다른 type들과 유사한 수준을 이루고 있었다. HAdV B species에 속하는 HAdV type 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55의 reference sequence와의 비교분석을 통해 총 40개의 단백질을 coding하는 40개의 ORF (Open Reading Frame)로 이루어져 있는 것을 확인하였다(Figure 1).

  각각 protein의 nucleotide 수준의 상동성(identity)을 비교해 본 결과, B1 subspecies와는 확연히 상동성이 떨어지며 B2 subspecies 내에서는 hexon, fiber protien 유전자부위를 제외하고(Table 2) 상동성이 type 간에 조금씩 차이는 보이나 아주 유사한 수준을 이루는 것을 볼 수 있었다.

  HAdV B species reference sequences와 재조합 HAdV type 11+34와의 계통유전학적 차이를 확인해 본 결과, HAdV B species reference sequences 중 HAdV type 11과 상동성 98.4 %로 계통 분류학적 위치도 가장 가까운 것을 확인하였다(Figure 2A). 그러나 HAdV typing에 주로 사용되는 penton, hexon, fiber 각각의 유전자만을 가지고 분석했을 시에는 penton과 hexon 유전자는 HAdV type 34와 가장 유사하였으며(Figure 2B, 2C) fiber 유전자는 HAdV type 11과 가장 유사한 것으로 나타났다(Figure 2D).

  또한 Simplot 프로그램을 이용해서 bootscan 분석을 통해 HAdV B species reference sequence와 비교하여 재조합 발생가능성을 분석해 본 결과, 재조합(recombinant) event가 확인이 되었다. 특히 Figure 3에서 보듯이 계통도(phylogenetic tree)와 유사하게 penton과 hexon 유전자는 HAdV type 34와 fiber 유전자에서는 HAdV type 11과 특이적으로 상동성을 가지는 것을 볼 수 있었다.

  Simplot 분석을 해 본 결과 또한 fiber는 HAdV type 11과 높은 상동성을 나타내며 hexon은 HAdV type 34와 높은 상동성을 나타내었으나 penton 중간 부분에서 HAdV type 34와 상동성이 떨어지는 부위가 발견이 되었다(Figure 4).

  이 부위의 유전자 염기서열을 분석해 본 결과, reference HAdV type 34에서 9개의 염기서열이 소실된 부분이 발견이 되었으며 염기서열 소실된 이후부터 재조합 HAdV type 11+34와 reference HAdV type 34와 상동성이 떨어지는 것을 확인하였다(Figure 5. red box; 재조합 HAdV type 11+34 기준 14,626 염기 시작). 9개의 염기서열 소실된 부위 앞, 뒤 염기서열에 대해 각각 재조합 HAdV type 11+34와 reference HAdV와의 상동성을 비교해 본 결과, 앞부분은 재조합 HAdV type 11+34와 HAdV type 34의 상동성은 98%, HAdV type 11과의 상동성은 94%를 나타내었으나 뒷부분의 상동성은 HAdV type 34와는 93%, HAdV type 11과는 98.4%, HAdV type 14와 55는 98.7%의 상동성을 나타내었다. 이 결과를 통해 재조합 HAdV type 11+34의 penton 유전자 내에서 HAdV의 유전자가 HAdV type 34과 유사한 유전자에서 HAdV type 11 또는 14 또는 55과 유사한 유전자로 전환된 것을 확인 할 수 있었다(Figure 5).

  재조합 HAdV type 11+34의 pVI gene (17,387-17,395nt)에서는 특이적으로 9개의 염기가 소실(deletion) 된 unique site가 확인 되었다(Figure 6). 이는 HAdV type 11+34를 분리하기 전 검체에서 추출한 핵산에서도 동일하게 9개의 염기가 소실 된 것으로 보아 바이러스 분리 단계에서 생긴 돌연변이나 염기서열분석 과정에서 발생한 오류가 아닌 재조합 HAdV type 11+34의 유전적 특징으로 보였다.


III. 맺는 말

  현재까지 HAdV type 34의 감염에 의한 공중보건학적 연구 보고는 거의 없으며, 간혹 산발적으로 보고된 몇몇의 경우에서는 신장 이식 환자나 에이즈(AIDS) 환자와 같이 면역이 결핍된 환자에게서 분리된 경우가 있으며 그중 결막염 또는 폐렴 환자에서 HAdV type 34가 확인 된 경우가 있었다[6-7]. HAdV type 11 또한 호흡기 HAdV에서는 주요 type은 아니지만 몇몇 나라의 군훈련소에서 급성호흡기 감염증 대발생과 관련이 있다는 연구결과가 일부 보고되어 있다[8].

  2010년 국내에서 발생된 HAdV의 유행 type을 파악하기 위하여 hexon 유전자 염기서열을 분석한 결과, 많은 비중을 차지하는 type은 HAdV type 3인 것으로 밝혀졌다. 전체적으로는 17종의 다양한 type이 확인되었으며, 그 중 HAdV type 11, type 34가 각각 1건씩 확인이 되었다. Hexon 염기 한가지만으로 type을 결정할 경우 재조합 형태의 HAdV를 간과할 가능성이 있었기 때문에 추가적인 실험으로 fiber 유전자 염기서열 분석을 통해 재조합 HAdV 존재를 분석하였으며, 그 결과 hexon 유전자 상으로 HAdV type 34로 나타났던 바이러스에서 fiber 유전자가 HAdV type 11로 나타남에 따라 전장 유전자 확보 및 분석 프로그램들을 통해 유전적 특징을 파악하였다.

  이러한 유전적 특징을 가진 HAdV는 아직 학계에 보고되지 않은 상황이며 국내에서 처음으로 분리된 것으로 파악 된다. 전장 유전자 길이 및 G+C content 같은 유전적 특징은 HAdV B species에 속하는 다른 type들과 유사한 수준을 이루고 있었으며 비록 비교 분석한 reference sequence가 coding하고 있는 단백질들이 몇몇 개가 다르긴 하나 공통적으로 확인되는 총 40개의 단백질을 확인하였다. MEGA4, Simplot 프로그램을 이용하여 유전적 특징을 분석한 결과, 전체적으로 HAdV type 11과 계통유전학적으로 가장 유사하나 penton과 hexon 유전자는 HAdV type 34과 가장 유사한 특징을 볼 수 있었다. 비록 HAdV type 11이 HAdV type 34, 35와 유전학적으로 유사하다는 보고가 있으나[10] 몇몇 유전자 분석 프로그램을 통해 확인해 본 결과, penton, hexon, fiber 유전자는 유전자 염기서열 분석을 통한 혈청형 결정 부위인 만큼 다른 부위에 비해 type 특이적인 유전적 특이성을 가지는 것을 볼 수 있었다. Figure 4와 5에서 penton 유전자 내 재조합 breakpoint를 기준으로 앞부분과 뒷부분의 HAdV 염기서열 분석을 한 결과, 염기서열 상동성이 높은 type이 앞부분 HAdV type 34에서 뒷부분 HAdV 11 또는 14 또는 15로 전환되는 것을 보았다. 이 결과를 통해 penton 부위는 다른 HAdV type의 유전자가 혼합되어있는 chimeric 유전자일 가능성을 확인 하였으며, 재조합 유전자의 발생원인 등은 좀 더 자세한 분석이 필요한 것으로 보인다. 이와 같은 분석 결과를 바탕으로 분리 확보한 HAdV가 현재까지 알려진 type이 아니며 유전자 재조합에 의해 발생된 새로운 재조합 HAdV type 11+34 strain이라는 것을 알 수 있었다.

  이번에 보고된 재조합 HAdV type 11+34가 분리된 지역 특성 중 하나는 유동인구가 빈번한 지역이었으며 특히 동기간에 지역사회에서 매우 다양한 호흡기 HAdV의 유행이 확인된 바 있다. 재조합 HAdV type 11+34에 감염된 환자의 역학적 특성으로는 10세의 남자 환자로서 일반적인 감기 증상인 발열, 기침, 두통 이외에 특이한 증상은 나타나지 않은 것으로 보고되었다. 비록 이 환자는 일반적인 상기도 감염 증상만을 나타낸 경우였으나 전 세계적으로 새롭게 출현하는 재조합 HAdV의 경우 종종 중증도와 밀접한 관련이 있다는 연구결과가 자주 보고되고 있는 상황이므로 바이러스 유전자 변이 및 재조합과 같은 유전학적 분석을 통한 기초 데이터 확보 및 향후 새로운 재조합 HAdV에 의한 중증의 상기도 감염 발생 여부에 주목할 필요가 있다. 특히 우리나라에서는 질병관리본부가 전국 시도 보건환경연구원과 공동으로 수행하고 있는 급성호흡기감염증 감시 사업(KINRESS)를 통하여 바이러스성 급성 상기도 감염증 원인 병원체에 대한 주기적 모니터링이 가능하므로 이번 새로운 유전자형을 가진 재조합 HAdV를 발견한 경험을 바탕으로 지속적인 신 변종 병원체 탐색이 요구된다고 할 수 있다. 아울러 새로운 HAdV 출현에 의해 나타나는 바이러스성 급성호흡기 감염 pattern 변화 등 공중보건에 미칠 가능성을 사전에 파악하여 국민의 건강을 보호하기 위해서는 이번에 새롭게 확인된 재조합 HAdV type 11+34의 바이러스학적 특성 분석 및 심층적인 병인론 연구 활성화가 필요할 것으로 생각된다.


IV. 참고문헌

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2. Robinson CM, Shariati F, Zaitshik J, Gillaspy AF, Dyer DW, et al. Human adenovirus type 19: genomic and bioinformatics analysis of ad keratoconjunctivitis isolate. Virus Res. 2009; 139: 122-26.
3. Rebelo-de-Andrade H, Pereira C, Gíria M, Prudêncio E, Brito MJ, Calé E, Taveira N. Outbreak of acute repiratory infection among infants in Lisbon, Porugal, caused by human adenovirus serotype 3 and a new 7/3 recombinant strain. J Clin Microbiol. 2010; 48(4): 1391-96.
4. Lee WJ. 2010년도 사람 아데노바이러스 3형에 의한 아데노바이러스 감염증 유행. PHWR. 2010; 4(40).
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7. Waka SI, Keico T, Eiichi U, Norihiko I, Shigeaki O, Koki A. Typing of adenovirus type 34 isolated in two cases of conjunctivitis in Spporo, Japan. J Clin Microbiol. 2001; 39(11): 4187-89.
8. Kajon AE, Dikckson LM, Metzgar D, Hounh HS, Lee V, Tan BH. Outbreak of febrile respiratory illness associated with adenovirus 11a infection in a Singapore military training camp, J Clin Microbiol. 2010; 48(4): 1438-41.
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10. Li QG, Hambraeus J, Wadell G. Genetic relationship between hirteen genomeypes of adenovirus 1, 34, and 35 with different tropisms. Interviol. 1991; 32(6): 338-50.