Abstract

BACKGROUND: Cases of emerging and re-emerging infectious diseases have increased due to various factors such as climate change, environmental pollution, and globalization. Rapid identification of the causative agents of unknown pathogens is crucial in preventing these diseases from becoming a widespread risk to public health. Thus, it is critical to evaluate the implementation of rapid identification systems that include the recently developing application of molecular methodology to the discovery of novel pathogens in instances of unknown infectious illnesses and worldwide epidemics.
CONCLUSIONS: Although molecular diagnostic techniques including high-throughput sequencing are being developed in various scopes and magnitudes, it is critical to retain and develop classical techniques such as virus isolation, electron microscopy and serological diagnosis. Among these classical methods, virus isolation in particular supports other diagnostic methods through the increase of virus titers that directly prove the presence of a novel pathogen. In addition, virus isolation will help in the development and verification of diagnostic tools, anti-viral drugs and vaccines. The combination of cell culture, electron microscopy, serological and genetic methods (including metagenomic analysis) is an unbiased approach to the identification of unrecognized pathogens. Collaboration among clinicians, epidemiologists, microbiologists, electron microscopists, and laboratorians who use different technologies is also critical for the successful investigation of unknown diseases.


Ⅰ. 들어가는 말

현재 보건 의료 기술이 발전하면서 다수의 감염병에 대한 백신 제제와 치료제들이 개발되고 있다. 그럼에도 불구하고, 지구 온난화 등 기후 및 환경의 변화, 생활환경 및 행동의 변화, 미생물의 진화 특성으로 인해 인수공통 감염병의 발생이 증가하고 있고, 사스(severe acute respiratory syndrome : SARS), 조류 인플루엔자, 에볼라바이러스병 같은 신변종 감염병이 국제적으로 출현하고 있으며, 앞으로도 지속적으로 출현할 것으로 예상된다[1](Figure 1, Table 1). 뿐만 아니라, 국가 간 교역과 세계 여행의 증가로 인해 우리나라에서 발생하지 않던 해외 감염병들이 국내로 유입될 가능성 또한 증가하였다. 실제로 해외에서 발생했던 웨스트나일열, 라임병, 치쿤구니아열 등의 국내 유입이 보고되는 등 감염병 발생양상에 변화가 일어나고 있다[2].

최근의 감염병 발생의 특성은 특정 지역에 국한하여 일시적으로 발생하기보다는 여러 지역에 걸쳐 수시로 발생하고, 확산 속도가 빠르다는 점이다. 따라서 신변종에 의한 원인불명 감염병 발생시, 사회적 혼란 및 국가적 재난으로 커질 우려가 있다. 공기를 통한 바이러스 감염의 경우 초기 대응이 중요하며, 초기 대응이 실패하면 국가적 위기 상황이 발생될 수 있어, 감염병 관리체계 강화 및 지속적인 대응 연구가 필요하다. 특히, 기존 진단 체계로 판정할 수 없는 원인 불명의 신변종 감염병이 발생하였을 때, 이후 확산 방지와 재발생시 진단을 위해 필수적으로 원인 병원체를 규명하는 연구가 진행되어야 한다.
그러므로 해외에서 발생한 신변종 및 재출현 바이러스 발생에 대한 관심과 모니터링이 전적으로 필요하며, 전염 확산이 빠른 긴급한 상황인 경우, 국가 예방 대책 차원에서 정확하고 빠른 진단과 신속한 대처가 중요한 역할을 한다.
이 글에서는 바이러스 진단 분야의 최첨단 기술이 개발되고 발전해 나가는 상황에서 세포배양을 통한 바이러스 분리배양법의 현황, 중요성과 의의를 기술하고자 한다.


Ⅱ. 몸 말

바이러스 규명 연구에서 그 동안은 세포 배양 기술을 이용한 바이러스 분리와 전자 현미경을 통한 형태학적 분류, 컨센서스 중합효소 연쇄반응(Consensus PCR), SISPA(Sequence-independent single primer amplification) 방법, 혈청학적 분석 등이 사용되어 왔다.
최근에는 Roche 454, Illumina와 같은 플랫폼을 기반으로 하는 대용량 시퀀싱(High-throughput sequencing, HTS) 기술과 임의적 증폭(arbitrary amplification) 기술을 활용하여 여러 가지 감염병을 진단하는 방법을 개발하거나 개선하는 노력이 여러 그룹에서 지속적으로 이루어지고 있다(Figure 2). 또한, VIDISCA (Virus Discovery based on cDNA Amplified Fragment Length Polymorphism)-454, Pathoscope, MetaVir, VirusHunter, VirusFinder와 같은 다양한 방법과 웹기반의 분석서비스, 분석 파이프라인 개발에 가속도가 붙고 있는 실정이다.
우리나라의 경우, 차세대염기서열분석(Next generation sequencing, NGS) 기술 수준은 매우 높은 편이지만 아직 진단분야에 대한 활용기술은 아직 실용화단계로 도입하지 못하였으며, 임상검체들을 대상으로 소수의 연구그룹에서 메타지노믹스 연구, 진단실패 검체에 대한 원인 규명 연구를 진행하고 있는 상황이다.
미국 질병관리본부(CDC), 독일 로버트코흐연구소(Robert Koch Institute), 네덜란드 에라스무스 대학(Erasmus University) 등 해외에서는 원인불명의 감염병 원인 규명을 위해 전자 현미경 관찰과 세포 배양을 포함한 기존 기술들부터 최신 NGS 분석 기술들을 체계적으로 모아 신변종의 감염병 발생에 대비하고 있다[5]. 실제 이런 체계를 통해 사스(SARS), 중동호흡기증후군(Middle east respiratory syndrome, MERS) 같은 신종 감염병을 규명한 사례들이 있다(Table 2).
최신 HTS 기술로 인해 특이적인 표적을 정할 필요가 없이 신속하게 대용량의 세균 및 바이러스의 유전자 정보를 확보하고, 분석할 수 있게 되었다. 그러나 HTS 기술에 기반한 원인바이러스 진단 연구는 바이러스 종에 따라 차이는 있으나 아직은 검출 한계(detection limit)가 높다는 점과 감염증을 유발하지 않는 정상 세균총(normal flora)에 대한 배제가 어렵다는 제한점이 있다. 최근까지도 세포배양을 통해 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)가 확인된 경우와 검체의 농축이 가능한 대변(stool)과 같은 시료에서는 NGS 유전자 분석 기술로 성공적인 결과가 나오지만, 호흡기바이러스의 경우에는 소량의 검체로 진단하므로 NGS 연구가 더디게 진행되고 있다.
유전자 분석을 통해 신종 병원체를 검출할 수 있어도 코흐의 공리(Koch’s Postulates)에 따라 질병의 원인을 명확히 검증할 필요가 있다. 또한, 새로운 감염병에 대한 분자생물학적 연구, 항체와 같은 치료제, 백신, 진단제의 개발 및 평가를 위해서는 세포 배양을 통한 바이러스 분리가 필수적이다. 최근 발견된 SARS, MERS와 같은 신종코로나바이러스, 메타뉴모바이러스와 같은 호흡기바이러스도 세포배양을 통해 먼저 바이러스가 분리되었고, 분리된 바이러스를 대상으로 유전자 분석을 수행함으로써 동정 및 확인되었다[6](Table 2).
전통적인 분리배양은 일반적으로 불멸화된 세포주나 동물에 감염시키는 방법이 주로 사용되는데, 바이러스의 종류나 수용체의 감수성에 따라 일반적인 세포주나 동물모델에서 배양이 잘 되지 않는 난배양성 바이러스가 배양이 잘되는 바이러스보다 매우 많다. 또한 바이러스의 배양에 소모되는 노동력과 시간 투자도 유전자 검사나 다른 진단 방법에 비해 많다. 하지만, 최근에는 세포배양기술의 발달로 배양에 소모되는 시간을 줄여줄 수 있고 바이러스에 대한 감수성을 넓히기 위한 방법이 시도되고 있다[7, 8](Table 3).

쉘바이알(Shell vial) 배양을 통한 바이러스 증식법의 경우, 세포를 쉘바이알 안에서 배양하고, 바이러스 감염시 손쉽게 원심분리를 통해 물리적으로 바이러스와 세포간의 감염 효율을 높여주게 된다. 이 방법을 적용하면 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 등과 같이 배양을 위해 14-21일 정도 걸리던 바이러스를 2-3일 안에 빠르게 증식시킬 수 있다. 일반적으로 한 종류의 세포주로 바이러스를 배양하고 분리하지만 바이러스 수용체(receptor)가 세포 내 한 종류가 아니라 여러 종류인 경우, 2-3가지 다른 세포주를 혼합 배양함으로 바이러스에 대한 민감도를 높이는 방법도 있다. 그러나 여전히 불멸화된 일반 세포주들 안에서 증식이 안 되는 바이러스들도 상당수 있고, 실제 조직이나 검체에서 채취한 바이러스인 경우, 실험실에 적응된 일반 세포주에서 증식이 억제되기도 한다. 그러므로 일반 세포주에서의 바이러스 분리법에 대한 단점들을 극복하고자 사람 조직과 비슷하게 분화시킨 유사 조직을 이용한 분리 방법도 주목할 만하다[9]. 난배양 호흡기바이러스의 경우, 사람 호흡기 기도 조직과 유사하게 분화시킨 기도 다열상층 상피 조직(well-differentiated pseudostratified airway epithelium)을 이용하기도 한다. 분화된 기도 다열상층 상피 조직은 직접 사람의 기도 상피조직에서 분리한 세포(human airway epithelial cell, HAE)를 공기-배양액 접점에서 배양 및 분화시켜 형성한 것으로, 이 분화된 HAE는 실제 사람의 기도처럼 섬모(cillia) 구조 및 점액(mucin) 분비의 기능을 갖추고 있기에 독성 실험, 천식 모델, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 질환 모델, 약 효능 실험 등에 주로 이용되고 있다. 최근 분화된 HAE로부터 세포주에서 배양하기 힘든 사람 보카바이러스, 사람 코로나바이러스 HKU1, 라이노바이로스 C를 배양하는데 성공하였고, 그 외 일반적인 호흡기바이러스들(인플루엔자바이러스 A, 파라인플루엔자바이러스, 호흡기융합세포바이러스, 아데노바이러스, 사스중증코로나바이러스)의 증식 및 배양도 보고되었다. 원인 불명의 호흡기바이러스 병원체를 분리하거나 난배양 호흡기바이러스 분리를 위하여 분화된 HAE가 유용할 것이다.
그 외에 단핵구(monocyte)나 대식세포(macrophage), 수지상세포(dendritic cell)와 같은 면역세포를 감염시키는 바이러스의 경우 사람 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)를 이용하여 바이러스 배양 및 분리할 수 있다. 바이러스가 세포에 감염이 되더라도 세포내 증식을 방해하는 인터페론(interferon)과 인터페론 수용체의 발현으로 바이러스 증식이 억제되기도 한다. 인터페론 발현을 감소시키는 화학물을 처리함으로써 바이러스 증식 효율을 향상시킨 사례가 있다. 이 방법도 바이러스 증식률을 높이고, 원인 불명 바이러스나 난배양 바이러스를 분리하는데 적용될 수 있다. 바이러스의 수용체는 매우 다양하여 세포주에 대한 감수성 범위가 매우 좁긴 하지만, 특정 수용체를 발현하는 재조합 세포주(transgenic cell)를 보유하는 경우는 유사 종의 임상분리주의 확보 및 바이러스의 변이 연구에 유용할 것으로 사료된다.
유전자 분석기술의 발달로 전통적인 병원체 배양 성공 후 원인규명 순서와 달리 최근에는 원인병원체 추정 이후 유전학적 재조합 기술을 이용한 배양 시스템 구축, 감염동물모델 개발의 순서를 따르기도 한다.


Ⅲ. 맺는말

2014년 서아프리카에서 에볼라바이러스병 재출현으로 인해 우리나라에서도 신변종 감염병 대응에 대한 관심이 급격히 높아졌고, 현재 질병관리본부에서는 신변종 등 감염병 위기 대응 연구를 중점과제로 선정하여 효율적으로 대응하기 위한 감시, 조기탐지, 원인규명, 전파 차단, 확산방지를 위한 연구를 수행하고 있다.
신속한 신변종 감염병 대응을 위해서는 NGS 방법 등의 유전자 분석법과 더불어 바이러스 분리, 확인 동정에 필요한 바이러스 세포 배양법을 최적화, 고도화하는 연구 개발이 반드시 필요하다. 이런 연구를 통해 원인불명의 감염병 발생시 향상된 바이러스 배양 능력을 바탕으로 바이러스 자원을 용이하게 확보할 수 있게 되고, 명확한 원인 병원체를 제시함으로써 감염병 대응 능력 향상에 기여할 것으로 기대된다. 또한 산업계, 의료계, 학계에서의 병인론 연구, 진단제, 치료제 및 백신 개발에 필수적인 자원을 제공함으로써, 감염병 차단을 위한 효율적인 전략 수립이 신속히 이루어져 사회동요 및 국민 불안을 최소화할 것으로 예상된다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Morse SS. 1995. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg Infect Dis. 1(1):7-15.
2. 질병관리본부, 2015년 감염병관리사업지침
3. Gayer M, et al. 2007. Conflict and emerging infectious diseases. Emerg Infect Dis. 13(11):1625-1631.
4. Chiu CY. 2013. Viral pathogen discovery. Curr Opin Microbiol. 16(4):468-478.
5. 이한샘, 이준우, 2014. 주간건강과 질병 제 7권 제35호:767-772.
6. Goldsmith CS, et al. 2013. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19(6):886-891.
7. Leland DS and Ginocchio CC. 2007. Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clin Microbiol Rev. 20(1):49-78.
8. Hodinka RL. 2013. Point: is the era of viral culture over in the clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol. 51(1):2-4.
9. Farsani SM, et al. 2015. Culturing of respiratory viruses in well-differentiated pseudostratified human airway epithelium as a tool to detect unknown viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9(1):51-57.